Проверить ву по базе: На сайте ГАИ теперь можно проверить подлинность прав водителя — Российская газета

Проверить КБМ по базе РСА можно на нашем сайте. Заявка на проверку скидки по ОСАГО оформляется за считанные секунды. От вас потребуется:

• Заполнить поле ФИО;
• Указать дату рождения;
• Вписать серию и номер водительского удостоверения;
• Дать согласие на обработку персональных данных.

Проверить КБМ онлайн может каждый страхователь. Данные берутся из актуальной базы РСА.

Если размер коэффициента бонус-малус покажется неправильным, вы всегда можете оформить заявку на восстановление КБМ

Чей КБМ можно проверить?

КБМ водителя

У каждого водителя свой КБМ по его страховой истории

КБМ собственника

В полисе без ограничений КБМ считается по КБМ собственника

Укажите в форме ФИО, дату рождения и номер водительского удостоверения

ФИО, дата рождения, номер паспорта собственника. Для запросов до 01.04.2019 еще нужен VIN

Нужен только ИНН. Для запросов до 01.04.2019 еще нужен VIN

Продлевай ОСАГО по лучшей цене!

Хао Ву | Факультет | О нас | Перельмана Медицинский факультет

Интересно, что ключевые эпигенетические ферменты, такие как семейство TET деоксигената ДНК и гистоновая деметилаза, содержащая JmjC-домен, напрямую используют кислород и некоторые основные метаболиты в качестве своих кофакторов для модификации эпигенетических меток на ДНК или гистоне, подтверждая идею о том, что клетки в многоклеточных организмах могут быстро адаптироваться к изменениям окружающей среды или метаболических состояний, динамически изменяя свои эпигеномы и программы экспрессии генов.

Наша лаборатория использует высокопроизводительные технологии секвенирования, биоинформатику, генетические модели млекопитающих, а также инструменты синтетической биологии для исследования механизмов, с помощью которых белки, которые записывают, считывают и стирают ДНК и модификации гистонов, способствуют развитию млекопитающих и соответствующим заболеваниям человека. Для достижения этой цели мы также заинтересованы в разработке новых методов секвенирования генома и программируемых методов модификации эпигенома для точного картирования и манипулирования этими модификациями ДНК в сложном геноме млекопитающих.

Проекты ротации: Пожалуйста, свяжитесь с Хао для получения более подробной информации.

Избранные публикации

О происхождении и продолжающейся эволюции SARS-CoV-2 | Национальный научный обзор

Аннотация

Эпидемия SARS-CoV-2 началась в конце декабря 2019 года в Ухане, Китай, и с тех пор затронула значительную часть Китая и вызвала серьезную озабоченность в мире.Здесь мы исследовали степень молекулярной дивергенции между SARS-CoV-2 и другими родственными коронавирусами. Хотя мы обнаружили только 4% вариабельности в геномных нуклеотидах между SARS-CoV-2 и коронавирусом, связанным с SARS летучих мышей (SARSr-CoV; RaTG13), разница в нейтральных сайтах составила 17%, что позволяет предположить, что расхождение между двумя вирусами намного больше. чем предполагалось ранее. Наши результаты предполагают, что развитие новых вариаций в функциональных сайтах в рецептор-связывающем домене (RBD) шипа, наблюдаемого в SARS-CoV-2 и вирусах SARSr-CoV панголинов, вероятно, вызвано естественным отбором, помимо рекомбинации.Популяционный генетический анализ 103 геномов SARS-CoV-2 показал, что эти вирусы имеют две основные линии (обозначенные L и S), которые четко определяются двумя разными SNP, которые показывают почти полное сцепление между вирусными штаммами, секвенированными на сегодняшний день. Мы обнаружили, что линия L была более распространена, чем линия S, в ограниченных выборках пациентов, которые мы исследовали. Значение этих эволюционных изменений в этиологии болезни остается неясным. Эти результаты убедительно подчеркивают острую необходимость в дальнейших комплексных исследованиях, сочетающих данные вирусного генома с эпидемиологическими исследованиями коронавирусной болезни 2019 года (COVID-19).

ВВЕДЕНИЕ

SARS-CoV-2 был обнаружен в конце декабря 2019 года в Ухане, столице провинции Хубэй в Центральном Китае. С тех пор он быстро распространился по Китаю и другим странам, что вызвало серьезную озабоченность во всем мире. Этот новый коронавирус, SARS-CoV-2, был назван из-за сходства его структуры с коронавирусами, связанными с тяжелым острым респираторным синдромом. По состоянию на 28 февраля 2020 года в Китае подтверждено 78 959 случаев заражения SARS-CoV-2, при этом 2791 человек умер.Вызывает беспокойство более 3664 подтвержденных случаев заболевания за пределами Китая в 46 странах и регионах (https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/situation-reports/), что создает серьезные проблемы для успешное сдерживание. Кроме того, геномные последовательности вирусов SARS-CoV-2, выделенные от ряда пациентов, имеют идентичность последовательностей выше 99,9%, что указывает на недавний перенос хозяина в человека [1–3].

Коронавирусы естественным образом являются хозяевами и эволюционно формируются летучими мышами [4,5].Действительно, было высказано предположение, что большинство коронавирусов у людей происходит из резервуара летучих мышей [6,7]. Несколько групп недавно подтвердили генетическое сходство между SARS-CoV-2 и бета-коронавирусом летучих мышей подрода Sarbecovirus [8–13]. Полногеномная последовательность нового вируса имеет 96,2% сходства с последовательностью связанного с SARS коронавируса летучих мышей (SARSr-CoV; RaTG13), собранной в провинции Юньнань, Китай [2,14], но имеет низкое сходство с последовательностью SARS- CoV (около 79%) или MERS-CoV (около 50%) [1,15].Также было подтверждено, что SARS-CoV-2 использует тот же рецептор, ангиотензинпревращающий фермент II (ACE2), что и SARS-CoV [2]. Хотя конкретный путь передачи от естественных резервуаров к человеку остается неясным [5,13], несколько исследований показали, что панголины могли обеспечить частичный ген spike для SARS-CoV-2; критические функциональные сайты в спайковом белке SARS-CoV-2 почти идентичны тем, которые идентифицированы в вирусе, выделенном от панголина [16–18].

Несмотря на эти недавние открытия, несколько фундаментальных вопросов, связанных с эволюционными моделями и движущими силами этой вспышки SARS-CoV-2, еще предстоит полностью охарактеризовать [19–21].Здесь мы исследовали степень молекулярной дивергенции между SARS-CoV-2 и другими родственными коронавирусами и провели популяционно-генетический анализ 103 секвенированных геномов SARS-CoV-2. Эта работа позволяет по-новому взглянуть на эволюцию SARS-CoV-2 и характер его распространения среди населения.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Молекулярная филогения и расхождение между SARS-CoV-2 и родственными коронавирусами

Для каждой аннотированной ORF в эталонном геноме SARS-CoV-2 (NC_045512) мы извлекли ортологичные последовательности SARS-CoV человека, четырех коронавирусов, связанных с SARS летучих мышей (SARSr-CoV: RaTG13, ZXC21, ZC45 и BM48- 31), один SARSr-CoV панголина из Гуандуна (GD) и шесть геномов SARSr-CoV панголина из Гуанси (GX) [18] (Таблица S1).Мы выровняли кодирующие последовательности (CDS) на основе выравнивания белков (см. Материалы и методы). Было обнаружено, что большинство ORF, аннотированных из SARS-CoV-2, консервативны в других вирусах, за исключением ORF8 и ORF10 (Таблица 1). Белковая последовательность SARS-CoV-2 ORF8 имеет очень низкое сходство с этими последовательностями в SARS-CoV и BM48-31, а ORF10 имеет преждевременный стоп-кодон как в SARS-CoV, так и в BM48-31 (рис. S1. ). Делеция одного основания вызвала мутацию со сдвигом рамки считывания в ORF10 ZXC21 (рис.S1).

Молекулярное расхождение между SARS-CoV-2 и родственными вирусами.

Молекулярное расхождение между SARS-CoV -2 и родственные вирусы.

Чтобы исследовать филогенетические отношения между этими вирусами в В геномной шкале мы объединили кодирующие области (CDS) девяти консервативных ORF ( orf1ab, E, M, N, S, ORF3a, ORF6, ORF7a, и ORF7b ) и реконструировали филогенетическое дерево с использованием синонимичных сайтов (рис. .1А). Мы также использовали CODEML в PAML [22] для определения предковой последовательности каждого узла и вычислили значения dN (несинонимичные замены на несинонимичный сайт), dS (синонимичные замены на синонимичный сайт) и dN / dS (ω) для каждой ветви. (Рис. 1А). Параллельно мы также рассчитали попарные значения dN, dS и ω между SARS-CoV-2 и другим вирусом (таблица 1).

Рис. 1.

Молекулярная дивергенция и давление отбора во время эволюции SARS-CoV-2 и родственных вирусов.(A) Филогенетическое дерево SARS-CoV-2 и родственных коронавирусов. Приведена длина ветви (dS), а в скобках указано значение dN / dS (ω). Филогенетическое дерево было реконструировано с использованием синонимичных сайтов в сцепленных CDS девяти консервативных ORF ( orf1ab, E, M, N, S, ORF3a, ORF6, ORF7a и ORF7b ). (B) Сохранение 6 критических аминокислотных остатков в белке шипа (S). Критическими активными центрами являются Y442, L472, N479, D480, T487 и Y491 в SARS-CoV, и они соответствуют L455, F486, Q493, S494, N501 и Y505 в SARS-CoV-2 (отмечены перевернутыми треугольниками). , соответственно.(C) Три кандидатных положительно выбранных сайта (отмечены перевернутыми треугольниками) в рецептор-связывающем домене (RBD) белка-шипа (S: 439 N, S: 483 V и S: 493Q) и окружающих 10 аминокислотах.

Рис. 1.

Молекулярная дивергенция и давление отбора во время эволюции SARS-CoV-2 и родственных вирусов. (A) Филогенетическое дерево SARS-CoV-2 и родственных коронавирусов. Приведена длина ветви (dS), а в скобках указано значение dN / dS (ω). Филогенетическое дерево было реконструировано с использованием синонимичных сайтов в сцепленных CDS девяти консервативных ORF ( orf1ab, E, M, N, S, ORF3a, ORF6, ORF7a и ORF7b ).(B) Сохранение 6 критических аминокислотных остатков в белке шипа (S). Критическими активными центрами являются Y442, L472, N479, D480, T487 и Y491 в SARS-CoV, и они соответствуют L455, F486, Q493, S494, N501 и Y505 в SARS-CoV-2 (отмечены перевернутыми треугольниками). , соответственно. (C) Три кандидатных положительно выбранных сайта (отмечены перевернутыми треугольниками) в рецептор-связывающем домене (RBD) белка-шипа (S: 439 N, S: 483 V и S: 493Q) и окружающих 10 аминокислотах.

Филогенетическое древо всего генома показало, что SARS-CoV-2 был наиболее близок к RaTG13, за ним следует GD Pangolin SARSr-CoV, затем GX Pangolin SARSr-CoV, затем ZC45 и ZXC21, затем SARS-CoV человека и наконец, BM48-31 (рис.1А). Примечательно, что мы обнаружили, что расхождение нуклеотидов в синонимичных сайтах между SARS-CoV-2 и другими вирусами было намного выше, чем предполагалось ранее. Например, хотя общие геномные нуклеотиды различаются примерно на 4% между SARS-CoV-2 и RaTG13, средний геномный dS составил 0,17, что означает расхождение в нейтральных сайтах между этими двумя вирусами 17% (Таблица 1). Обратите внимание, что несинонимичные сайты обычно подвергаются более сильному отрицательному отбору, чем синонимичные сайты, и вычисление различий в последовательностях без разделения этих двух классов сайтов может недооценить степень молекулярной дивергенции в несколько раз.

Мы обнаружили, что значение dS значительно варьировалось в зависимости от генов SARS-CoV-2 и других проанализированных вирусов. В частности, ген spike ( S ) постоянно демонстрировал более высокие значения dS, чем другие гены (Таблица 1). Эта закономерность стала ясной, когда мы вычислили значение dS для каждой ветви на фиг. 1A для гена spike по сравнению с конкатенированными последовательностями остальных генов (фиг. S2). В каждой ветви dS шипа было в 2,29 ± 1,45 (среднее ± стандартное отклонение) раза больше, чем у других генов.Это чрезвычайно повышенное значение dS spike может быть вызвано либо высокой скоростью мутаций, либо естественным отбором, который способствует синонимичным заменам. Синонимичные замены могут служить еще одним слоем генетической регуляции, определяя эффективность трансляции мРНК путем изменения использования кодонов [23]. Если положительный отбор является движущей силой для более высокой частоты синонимичных подстанций, наблюдаемой в спайке , мы ожидаем, что частота оптимальных кодонов (FOP) спайка будет отличаться от частоты других генов.Однако наш анализ систематической ошибки использования кодонов (таблица S2) предполагает, что FOP спайка был лишь немного выше, чем средний геномный показатель (0,717 против 0,698, см. Материалы и методы). Таким образом, мы полагаем, что повышенная скорость синонимичных замен, измеренная в spike , с большей вероятностью вызвана более высокой частотой мутаций; однако лежащий в основе молекулярный механизм остается неясным.

И SARS-CoV, и SARS-CoV-2 связываются с ACE2 через RBD шипового белка, чтобы инициировать слияние мембран и проникнуть в клетки человека [1,2,24–28].Пять из шести критических аминокислотных остатков (AA) в RBD различались между SARS-CoV-2 и SARS-CoV (рис. 1B), а трехмерный структурный анализ показал, что пик SARS-CoV-2 был выше. сродство связывания с ACE2, чем с SARS-CoV [25]. Интересно, что эти шесть критических АК идентичны между GD Pangolin-CoV и SARS-CoV-2 [16]. Напротив, хотя геномы SARS-CoV-2 и RaTG13 в целом более схожи, только один из шести функциональных сайтов у этих двух вирусов идентичен (рис.1Б). Было высказано предположение, что область RBD SARS-CoV-2 белка-шипа могла возникнуть в результате недавних событий рекомбинации у ящеров [16-18]. Хотя несколько древних событий рекомбинации были описаны в spike [29,30], также кажется вероятным, что идентичные функциональные сайты в SARS-CoV-2 и GD Pangolin-CoV могут на самом деле возникать в результате случайной конвергентной эволюции [18].

Если бы функциональные остатки AA в области RBD SARS-CoV-2 были получены от GD Pangolin-CoV в результате недавней рекомбинации, можно было бы ожидать, что нуклеотидные последовательности этой области будут почти идентичными у двух вирусов.Однако для последовательностей CDS, которые охватывают пять критических сайтов AA в спайке SARS-CoV-2 (в диапазоне от кодона 484 до 507, охватывающем пять смежных функциональных сайтов: F486, Q493, S494, N501 и Y505; рис. S3), мы оценили dS = 0,411, dN = 0,019 и ω = 0,046 между SARS-CoV-2 и GD Pangolin-CoV. Если предположить, что скорость синонимичного замещения ( u ) составляет 1,67–4,67 × 10 ^–3 / сайт / год, как оценивается в SARS-CoV [31], рекомбинация / интрогрессия, если она вообще имела место, была бы оценена случиться примерно 19.2–53,7 года назад. Здесь формула | $ t \ = \ dS / ({u \ times \ 2 \ \ times \ 2.29}) $ | использовался для расчета времени расхождения; Обратите внимание, что для этого расчета учитывалась повышенная частота мутаций шипа . Таким образом, кажется очень маловероятным, что SARS-CoV-2 произошел от GD Pangolin-CoV из-за совсем недавнего события рекомбинации. Скорее, более вероятно, что высокая частота мутаций в шипе в сочетании с сильным естественным отбором сформировала идентичные функциональные остатки AA между этими двумя вирусами, как предполагалось ранее [18].Хотя эти сайты поддерживаются в SARS-CoV-2 и GD Pangolin-CoV, мутации могли изменить остатки в линии RaTG13 после того, как она отделилась от SARS-CoV-2 (синяя стрелка на рис. 1A). Таким образом, общая идентичность критических сайтов AA между SARS-CoV-2 и GD Pangolin-CoV может быть обусловлена ​​случайными мутациями, связанными с естественным отбором, а не рекомбинацией.

Селективные ограничения и положительный отбор во время эволюции SARS-CoV-2 и родственных коронавирусов

Значение ω для всего генома SARS-CoV-2 и других вирусов варьировалось от 0.От 044 до 0,124 (таблица 1), что свидетельствует о сильном отрицательном отборе на несинонимичных сайтах. Другими словами, от 87,6% до 95,6% несинонимичных мутаций было удалено отрицательным отбором во время вирусной эволюции. Чтобы определить степень положительного отбора, мы объединили последовательности CDS 9 консервативных открытых рамок считывания во всех вирусах на рис. 1A и подобрали M7 (бета: нейтральный и отрицательный отбор) и M8 (бета + ω> 1: нейтральный, отрицательный отбор. , и положительный отбор) с использованием CODEML (Материалы и методы).Модель M8 ( lnL = −104 813,732, np = 18) была значительно лучше подходящей, чем модель M7 ( lnL = −105 063,284, np = 16) ( P <10 ⁻¹⁰ ), предполагая, что некоторые замены AA были одобрены положительным дарвиновским отбором (но не обязательно в линии SARS-CoV-2). В рамках модели M8 98,48% ( p ₀ ) несинонимичных замен были оценены при нейтральной эволюции или очищающем отборе (0 ≤ ω ≤1), и 1.52% ( p ₁ ) несинонимичных замен находились под положительным отбором (ω = 1,50). Байесовский эмпирический байесовский анализ (BEB) подтвердил, что 10 AA сайтов показали сильные сигналы положительного отбора, и, что интересно, три из них были расположены в RBD спайка, в том числе в одном критическом сайте (Fig. 1C и Fig. S4). Таким образом, хотя эти коронавирусы, как правило, подвергались очень сильному отрицательному отбору, положительный отбор также отвечал за эволюцию белковых последовательностей.Эти предположительно выбранные сайты заслуживают дальнейших функциональных исследований.

Мутации в 103 геномах SARS-CoV-2

Мы загрузили 103 общедоступных генома SARS-CoV-2, выровняли последовательности и идентифицировали генетические варианты. Для простоты визуализации мы пометили каждый штамм вируса на основе местоположения и даты выделения вируса в формате «Location_Date» на протяжении всего исследования (подробности см. В таблице S1; каждый идентификатор не содержал информации о расе или этнической принадлежности пациента). .Хотя SARS-CoV-2 представляет собой РНК-вирус, для простоты мы представили наши результаты, основанные на результатах секвенирования ДНК на протяжении всего этого исследования (, то есть , нуклеотид T (тимин) означает U (урацил) в SARS-CoV-2). Для каждого варианта предковое состояние было выведено на основании генома и выравнивания CDS SARS-CoV-2 (NC_045512), RaTG13 и GD Pangolin-CoV (Материалы и методы). Всего мы идентифицировали мутации в 149 сайтах в 103 секвенированных штаммах. Были однозначно выведены родовые состояния 43 синонимичных, 83 несинонимичных и двух мутаций стоп-выигрыша.Частотные спектры синонимичных и несинонимичных мутаций представлены на рис. 2.

Рисунок 2.

Частотные спектры производных мутаций 103 вирусов SARS-CoV-2. Обратите внимание на то, что производные аллели синонимичных мутаций смещены в сторону более высоких частот, чем аллели несинонимичных мутаций.

Рисунок 2.

Частотные спектры производных мутаций 103 вирусов SARS-CoV-2. Обратите внимание на то, что производные аллели синонимичных мутаций смещены в сторону более высоких частот, чем аллели несинонимичных мутаций.

Большинство полученных мутаций были одиночными (65,1% (28/43) синонимичных мутаций и 84,3% (70/83) несинонимичных мутаций), что указывает либо на недавнее происхождение [32], либо на рост популяции [33]. В целом производные аллели синонимичных мутаций были значительно искажены в сторону более высоких частот, чем таковые несинонимичных мутаций ( P <0,01, критерий суммы рангов Вилкоксона; рис.2), предполагая, что несинонимичные мутации, как правило, отбирались против. Однако 16,3% (7 из 43) синонимичных мутаций и одна несинонимичная (ORF8 (L84S, 28,144)) мутация имели производную частоту ≥ 70% для штаммов SARS-CoV-2.Несинонимичные мутации, которые привели к аллелям как минимум двух штаммов SARS-CoV-2, затронули шесть белков: orf1ab (A117T, I1607V, L3606F, I6075T), S (h59Y, V367F), ORF3a (G251V), ORF7a (P34S), ORF8. (V62L, S84L) и N (S194L, S202N, P344S).

Две основные линии SARS-CoV-2, определяемые двумя связанными SNP

Чтобы обнаружить возможную рекомбинацию среди вирусов SARS-CoV-2, мы использовали Haploview [34] для анализа и визуализации паттернов неравновесия по сцеплению (LD) между вариантами с минорными аллелями как минимум в двух штаммах SARS-CoV-2 (рис.3А). Поскольку большинство мутаций происходили с очень низкой частотой, неудивительно, что многие пары имели очень низкое значение r ² или LOD (рис. 3B и C). В соответствии с недавним отчетом [33], мы не нашли доказательств рекомбинации между штаммами SARS-CoV-2.

Рисунок 3.

Неравновесие по сцеплению между SNP в вирусах SARS-CoV-2. (A) График LD любых двух пар SNP среди 29 сайтов, которые имеют минорные аллели как минимум в двух штаммах.Число возле косой черты вверху изображения показывает координаты сайтов в геноме. Цвет в квадрате дан по стандарту (D ‘/ LOD), а число в квадрате — r ² значение. (B) r ² каждой пары SNP ( y -ось) против геномного расстояния между этой парой ( x -ось). (C) LOD каждой пары SNP ( y -ось) против геномного расстояния между этой парой ( x -ось). Обратите внимание, что как в (B), так и в (C) красная точка представляет собой LD между SNP в 8,782 и 28,144.

Рисунок 3.

Неравновесие по сцеплению между SNP в вирусах SARS-CoV-2. (A) График LD любых двух пар SNP среди 29 сайтов, которые имеют минорные аллели как минимум в двух штаммах. Число возле косой черты вверху изображения показывает координаты сайтов в геноме. Цвет в квадрате дан по стандарту (D ‘/ LOD), а число в квадрате — r ² значение. (B) r ² каждой пары SNP ( y -ось) против геномного расстояния между этой парой ( x -ось).(C) LOD каждой пары SNP ( y -ось) против геномного расстояния между этой парой ( x -ось). Обратите внимание, что как в (B), так и в (C) красная точка представляет собой LD между SNP в 8,782 и 28,144.

Однако мы обнаружили, что SNP в местоположении 8,782 ( orf1ab : T8517C, синоним) и 28,144 ( ORF8 : C251T, S84L) показали значительную связь со значением r ² , равным 0,954 (рис. 3B). , красный) и значение LOD 50,13 (рис. 3C, красный).Среди 103 штаммов вируса SARS-CoV-2 101 из них продемонстрировал полное сцепление между двумя SNP: 72 штамма имели гаплотип «CT» (определяемый как линия «L», потому что T28,144 находится в кодоне лейцина) и 29 штаммов. штаммы проявляли гаплотип «TC» (определяемый как линия «S», потому что C28,144 находится в кодоне серина) в этих двух сайтах. Таким образом, мы разделили вирусы SARS-CoV-2 на две основные линии, при этом L является основным (~ 70%), а S — второстепенным (~ 30%).

Эволюционная история линий L и S

Хотя мы определили линии L и S на основе двух тесно связанных SNP, что поразительно, разделение между линиями L (синий) и S (красный) сохранялось, когда мы реконструировали сети гаплотипов с использованием всех SNP в SARS-CoV- 2 генома (рис.4А; количество мутаций между двумя соседними гаплотипами вычислялось экономно). Этот анализ также подтверждает идею о том, что два связанных SNP на сайтах 8,782 и 28,144 адекватно определяют L- и S-линии SARS-CoV-2.

Рисунок 4.

Анализ гаплотипов вирусов SARS-CoV-2. (A) Сети гаплотипов вирусов SARS-CoV-2. Синий представляет линию передачи L, а красный — линию передачи S. Обратите внимание, что в этом исследовании мы пометили каждый образец уникальным идентификатором, начиная с геологического местоположения и заканчивая датой выделения вируса (подробности см. В таблице S1).Каждый идентификатор не содержал информации о расе или этнической принадлежности пациента. ZJ, Zhejiang; YN, Юньнань; WH, Ухань; США, Соединенные Штаты Америки; TW, Тайвань; SZ, Шэньчжэнь; SD, Шаньдун; Южная Каролина, Сычуань; JX, Цзянси; JS, Цзянсу; HZ, Ханчжоу; GZ, Гуанчжоу; GD, Гуандун; ФС, Фошань; CQ, Чунцин. (B) Эволюция линий L и S вирусов SARS-CoV-2. ‘.’, Нуклеотидная последовательность идентична; ‘-‘, зазор.

Рисунок 4.

Анализ гаплотипов вирусов SARS-CoV-2. (A) Сети гаплотипов вирусов SARS-CoV-2.Синий представляет линию передачи L, а красный — линию передачи S. Обратите внимание, что в этом исследовании мы пометили каждый образец уникальным идентификатором, начиная с геологического местоположения и заканчивая датой выделения вируса (подробности см. В таблице S1). Каждый идентификатор не содержал информации о расе или этнической принадлежности пациента. ZJ, Zhejiang; YN, Юньнань; WH, Ухань; США, Соединенные Штаты Америки; TW, Тайвань; SZ, Шэньчжэнь; SD, Шаньдун; Южная Каролина, Сычуань; JX, Цзянси; JS, Цзянсу; HZ, Ханчжоу; GZ, Гуанчжоу; GD, Гуандун; ФС, Фошань; CQ, Чунцин.(B) Эволюция линий L и S вирусов SARS-CoV-2. ‘.’, Нуклеотидная последовательность идентична; ‘-‘, зазор.

Чтобы определить эволюционные изменения, связанные с линиями L и S, мы исследовали геномное выравнивание SARS-CoV-2 и других родственных вирусов. Поразительно, но нуклеотиды линии S в сайтах 8,782 и 28,144 были идентичны ортологическим сайтам в наиболее близких вирусах (рис. 4B). Примечательно, что оба сайта были хорошо сохранены и для других вирусов.Следовательно, хотя линия L (~ 70%) была более распространенной, чем линия S (~ 30%) в исследованных нами вирусах SARS-CoV-2, линия S была эволюционно более связана с коронавирусами животных.

Для дальнейшего изучения взаимосвязи между штаммами в линиях L и S мы реконструировали филогенетическое дерево всех 103 вирусов SARS-CoV-2 на основе их полногеномных последовательностей. Наше филогенетическое древо также ясно показывает разделение двух линий (рис. 5). Вирусы линии L (синий) сгруппированы вместе, и аналогично вирусы линии S (красный) также были более тесно связаны друг с другом.Таким образом, наши полногеномные сравнения дополнительно подтверждают разделение линий L и S.

Рисунок 5.

Некорневое филогенетическое древо 103 геномов SARS-CoV-2. Идентификатор каждого образца такой же, как на фиг. 4A. Примечание WH_2019 / 12 / 31.a представляет собой эталонный геном (NC_045512). Обратите внимание, что SZ_2020 / 01 / 13.a имел C в положениях 8,782 и 28,144 в геноме, не принадлежащих ни к L, ни к S линиям.

Рис. 5.

Некорневое филогенетическое древо 103 геномов SARS-CoV-2.Идентификатор каждого образца такой же, как на фиг. 4A. Примечание WH_2019 / 12 / 31.a представляет собой эталонный геном (NC_045512). Обратите внимание, что SZ_2020 / 01 / 13.a имел C в положениях 8,782 и 28,144 в геноме, не принадлежащих ни к L, ни к S линиям.

Кроме того, наш анализ мутационной нагрузки показал, что линия L накопила значительно большее количество производных мутаций, чем линия S ( P <0,0001, критерий суммы рангов Вилкоксона; рис. S5). В будущих исследованиях необходимо выяснить, могут ли эти две линии иметь разные скорости передачи или репликации.

Эти результаты подтверждают мнение о том, что две линии вирусов SARS-CoV-2 могли испытывать разное селективное давление. Следует отметить, что приведенный выше анализ был основан на ограниченных геномах SARS-CoV-2, которые были собраны из разных мест в разные моменты времени. Для дальнейшей проверки нашей гипотезы требуются более полные геномные данные.

Гетероплазма вирусов SARS-CoV-2 у пациентов

Мы обнаружили, что последовательность вирусов, выделенная от одного пациента, проживавшего в США

21 января (USA_2020 / 01/21.a, GISAID ID: EPI_ISL_404253) имел генотип Y (C или T) в обеих позициях 8,782 и 28,144, что отличается от общей тенденции наличия либо C, либо T. Хотя новые мутации могут привести к такому результату, самое экономное объяснение заключается в том, что этот пациент мог быть инфицирован как линиями L, так и S (рис. 6). Образец USA_2020 / 01 / 21.a был взят у 63-летней пациентки, проживающей в Чикаго (из GISAID). На основе отчета Центров США по контролю и профилактике заболеваний (https: // www.cdc.gov/media/releases/2020/p0124-second-travel-coronavirus.html).

Рисунок 6.

Гетероплазмия вирусов SARS-CoV-2 у людей. Вирусы, выделенные от пациента, проживавшего в США (USA_2020 / 01 / 21.a, GISAID ID: EPI_ISL_404253), имели генотип Y (C или T) на уровне 8,782 и 28,144. Наиболее вероятное объяснение состоит в том, что этот пациент был инфицирован как линиями L, так и S. Обратите внимание, что это ссылка на происхождение L.

Рисунок 6.

Гетероплазмия вирусов SARS-CoV-2 у людей. Вирусы, выделенные от пациента, проживавшего в США (USA_2020 / 01 / 21.a, GISAID ID: EPI_ISL_404253), имели генотип Y (C или T) на уровне 8,782 и 28,144. Наиболее вероятное объяснение состоит в том, что этот пациент был инфицирован как линиями L, так и S. Обратите внимание, что это ссылка на происхождение L.

Для дальнейшего исследования гетероплазмии вирусов SARS-CoV-2 у пациентов мы провели поиск в 12 библиотеках глубокого секвенирования геномов SARS-CoV-2, которые были депонированы в Архиве чтения последовательностей (SRA) (Таблица S3, Материалы и методы) .Мы обнаружили 17 геномных сайтов, которые продемонстрировали доказательства гетероплазмии вируса SARS-CoV-2 у пяти пациентов, но мы не нашли других случаев сосуществования линий L и S ни у одного пациента (таблица 2). Эти результаты указывают на сложность эволюции SARS-CoV-2. Дальнейшие исследования, изучающие, как разные аллели вирусов SARS-CoV-2 конкурируют друг с другом, будут иметь большое значение.

Гетероплазмия вирусов SARS-CoV-2 у людей.

ОБСУЖДЕНИЕ

В этом исследовании мы исследовали закономерности молекулярной дивергенции между SARS-CoV-2 и другими родственными коронавирусами. Хотя геномный анализ показал, что SARS-CoV-2 был наиболее близок к RaTG13, их разница в нейтральных сайтах была намного выше, чем предполагалось ранее. Наши результаты предоставляют новые идеи для отслеживания промежуточного естественного хозяина SARS-CoV-2. Путем популяционно-генетического анализа 103 геномов SARS-CoV-2 мы обнаружили, что вирусы SARS-CoV-2 имеют две основные линии (линии L и S), и эти две линии четко определены всего двумя SNP, которые показывают полное сцепление между Штаммы SARS-CoV-2.Было обнаружено, что линия L (~ 70%) более распространена, чем линия S (~ 30%), в исследованных нами вирусах SARS-CoV-2, наш эволюционный анализ показал, что S, по-видимому, больше связана с коронавирусами у животных.

Поскольку несинонимичные сайты обычно подвергаются более сильному отрицательному отбору, чем синонимичные сайты, вычисление различий в последовательностях без разделения этих двух классов сайтов может привести к потенциально значительной недооценке степени молекулярной дивергенции. Например, хотя общие нуклеотиды между SARS-CoV-2 и RaTG13 различались только на ~ 4%, среднее значение dS для генома, которое обычно является нейтральным прокси, было равно 0.17 между этими двумя вирусами (Таблица 1). Следует отметить, что значение dS для всего генома составляет 0,012 между людьми и шимпанзе [35] и 0,08 между людьми и макаками-резусами [36]. Таким образом, нейтральная молекулярная дивергенция между SARS-CoV-2 и RaTG13 в 14 раз больше, чем между людьми и шимпанзе, и в два раза больше, чем между людьми и макаками. Среднее геномное значение dS между SARS-CoV-2 и GD Pangolin-CoV составляет 0,469, что сопоставимо со значением dS между людьми и мышами (0,5) [37], а значение dS между SARS-CoV-2 и GX Pangolin-Cov еще больше (0.722). Масштаб этих мер предполагает, что нам, возможно, следует учитывать разницу в нейтральном развивающемся сайте, а не разницу во всех нуклеотидных последовательностях при отслеживании происхождения и естественного промежуточного хозяина SARS-CoV-2.

В этой работе мы предлагаем разделить SARS-CoV-2 на две основные линии (L и S). Интересно, что линии S и L могут быть четко определены только двумя тесно связанными SNP в положениях 8,782 ( orf1ab : T8517C, синоним) и 28,144 ( ORF8, : C251T, S84L). orf1ab , который кодирует репликазу / транскриптазу, необходим для репликации вирусного генома, а также может быть важным для вирусного патогенеза [38]. Хотя мутация T8517C в orf1ab не изменяет последовательность белка (она меняет кодон AGT (Ser) на AGC (Ser)), она может повлиять на трансляцию orf1ab , поскольку AGT является предпочтительным, а AGC — нежелательным (Таблица S2). ORF8 способствует экспрессии ATF6, фактора ответа развернутого белка ER в клетках человека [39].Таким образом, будет интересно исследовать функцию изменения S84L AA в ORF8, а также комбинаторный эффект этих двух мутаций в патогенезе SARS-CoV-2.

Как отмечалось ранее [19], данные, изученные в этом исследовании, все еще очень ограничены, и для лучшего понимания эволюции и эпидемиологии SARS-CoV-2 необходим последующий анализ большего набора данных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Молекулярная эволюция SARS-CoV-2 и других родственных вирусов

Набор из 103 полных последовательностей генома был загружен с GISAID (Глобальная инициатива по обмену всеми данными о гриппе; https: // www.gisaid.org/) с признательностью, GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) и NMDC (http://nmdc.cn/#/nCoV). Последовательности и аннотации эталонного генома SARS-CoV-2 (NC_045512) и других родственных вирусов были загружены из GenBank, GISAID или Genome Warehouse. Два генома коронавируса из Guangdong Pangolins были загружены из GISAID (EPI_ISL_410544) и Genome Warehouse (GWHABKW00000000; подтверждение см. В таблице S1). Мы объединили их, чтобы построить согласованную последовательность. Геномные последовательности SARS-CoV-2 были выровнены с использованием MUSCLE v3.8.31 [40].

Аннотированные CD-диски других вирусов были загружены из GenBank. Чтобы избежать пропуска аннотаций в других вирусах, мы также аннотировали ORF, используя CDS, аннотированные в SARS-CoV-2, используя Exonerate (–model protein2genome: bestfit –score 5 -g y) [41]. Последовательности белка SARS-CoV-2 и других родственных вирусов были выровнены с MUSCLE v3.8.31 [40], а выравнивание кодонов было выполнено на основе выравнивания белков с RevTrans [42]. Выравнивания кодонов консервативных ORF были дополнительно объединены для последующего эволюционного анализа.Филогенетическое дерево было построено методом объединения соседей в MEGA-X [43] с использованием параметров 2-параметрической модели Кимуры, при этом учитывались только третьи позиции кодонов. YN00 из PAML v4.9a [22] использовался для расчета попарного расхождения между SARS-CoV-2 и другими вирусами для каждого отдельного гена или для сцепленных последовательностей. Модель свободного отношения в CODEML в пакете PAML [22] использовалась для расчета значений dN, dS и ω для каждой ветви.

Положительно выбранные аминокислоты

Положительный отбор был обнаружен с помощью EasyCodeML [44], недавно опубликованной оболочки CODEML [22].Сравнивались модели M7 и M8. В модели M7 ω следует бета-распределению таким образом, что 0 ≤ ω ≤ 1, а в модели M8 доля сайтов p ₀ имеет ω, взятую из бета-распределения, а остальные сайты имеют долю p ₁ положительно выбраны и имеют ω ₁ > 1. LRT между моделями M7 и M8 были проведены путем сравнения удвоенной разницы в значениях логарифма правдоподобия (2 ln Δl) с распределением χ ² (df = 2). Положительно выбранные сайты были идентифицированы с оценкой байесовского эмпирического байесовского балла (BEB) больше 0.95.

Сеть гаплотипов

DnaSP v6.12.03 [45] использовался для генерации данных выровненных по множеству последовательностей гаплотипов, а PopART v1.7 [46] использовался для построения сетей гаплотипов на основе гаплотипов, созданных DnaSP. RAxML v8.2.12 [47] был использован для построения филогенетического дерева максимального правдоподобия 103 выровненных геномов SARS-CoV-2 с параметрами «-p 1234 -m GTRCAT».

Процесс вызова SNP

Мы загрузили 12 библиотек метагеномного секвенирования SARS-CoV-2 (таблица S2) и сопоставили показания NGS с эталонным геномом SARS-CoV-2 (NC_045512) с помощью BWA (0.7.17-r1188) [48] с параметрами по умолчанию. Вызов SNP выполнялся с использованием bcftools mpileup (bcftools 1.9) [49].

Анализ систематической ошибки использования кодонов

Мы рассчитали значение RSCU (Relative Synonymous Codon Usage) для каждого кодона в эталонном геноме SARS-CoV-2 (NC_045512). Значение RSCU для каждого кодона представляло собой наблюдаемую частоту этого кодона, деленную на его ожидаемую частоту при равном использовании среди аминокислот [50]. Кодоны с RSCU> 1 были определены как предпочтительные кодоны, а с RSCU <1 были определены как нежелательные кодоны.Значение FOP (частота оптимальных кодонов) каждого гена рассчитывали как количество предпочтительных кодонов, деленное на общее количество предпочтительных и нежелательных кодонов.

Благодарности

Авторы благодарят исследователей, которые сгенерировали и поделились данными секвенирования из GISAID (https://www.gisaid.org/), на которых основано это исследование. Мы благодарим доктора Чун-И Ву, Хун Ву, Хунья Гу, Липин Вэй, Сюэмэй Лу, Вэйвэй Чжай, Гуодун Ван, Сяодун Су, Кепин Ху и Лейлян Чжан за содержательные комментарии к этому исследованию.Эта работа была поддержана грантом Национального фонда естественных наук Китая (№301) компании J.L. JC при поддержке программы CAS Pioneer Hundred Talents Program.

Заявление о конфликте интересов. Не заявлено.

ССЫЛКИ

Лю

R

Zhao

X

Li

J

Геномная характеристика и эпидемиология нового коронавируса 2019 г .: влияние на происхождение вируса и связывание с рецептором

Ланцет

2020

395

565

74

Чжоу

-П

Ян

XL

Ван

XG

Вспышка пневмонии, связанная с новым коронавирусом, вероятно, происхождения летучих мышей

Природа

2020

579

270

3

Ren

L-L

Wang

Y-M

Wu

Z-Q

Идентификация нового коронавируса, вызывающего тяжелую пневмонию у человека

Chin Med J

2020

133

1015

24

Cui

Дж

Li

F

Shi

Z-L

Происхождение и эволюция патогенных коронавирусов

Nat Rev Microbiol

2019

17

181

92

Ли

Х

Song

Y

Wong

G

Летучая мышь: происхождение нового коронавируса человека: туда и обратно

Sci China Life Sci

2020

63

461

2

Ли

Вт

Shi

Z

Yu

M

Летучие мыши являются естественными резервуарами SARS-подобных коронавирусов

Наука

2005

310

676

9

Домингес

SR

O’Shea

TJ

Oko

LM

Обнаружение коронавирусов группы 1 у летучих мышей в Северной Америке

Emerg Infect Dis

2007

13

1295

300

Wu

А

Peng

Y

Huang

B

Состав генома и расхождение нового коронавируса (2019-nCoV), происходящего из Китая

Cell Host Microbe

2020

27

325

8

Сюй

Х

Chen

P

Wang

J

Эволюция нового коронавируса в результате продолжающейся вспышки в Ухане и моделирование его шипового белка для оценки риска передачи вируса от человека

Sci China Life Sci

2020

63

457

60

Бенвенуто

D

Giovanetti

M

Ciccozzi

A

Эпидемия нового коронавируса 2019 года: свидетельства эволюции вируса

J Med Virol

2020

92

455

9

Чжу

N

Zhang

D

Wang

W

Новый коронавирус от пациентов с пневмонией в Китае, 2019

N Engl J Med

2020

382

727

33

Чан

JF

Kok

KH

Zhu

Z

Геномная характеристика нового патогенного для человека коронавируса 2019 г., выделенного от пациента с атипичной пневмонией после посещения Ухани

Emerg Microbes Infect

2020

9

221

36

Вэй

Х

Li

X

Cui

J

Перспективы эволюции новых коронавирусов, выявленных при пневмонии в Китае

Национальная научная редакция

2020

7

239

42

Параскевис

D

Костаки

EG

Magiorkinis

G

Полногеномный эволюционный анализ нового вируса короны (2019-nCoV) отвергает гипотезу появления в результате недавнего события рекомбинации

Инфекция Genet Evol

2020

79

104212

Гралински

LE

Menachery

VD

Возвращение коронавируса: 2019-nCoV

Вирусы

2020

12

135

Вонг

MC

Cregeen

SJJ

Ajami

NJ

Доказательства рекомбинации коронавирусов, указывающие на происхождение nCoV-2019 из панголинов

bioRxiv

2020

Сяо

К

Чжай

J

Feng

Y

Выделение и характеристика коронавируса, подобного 2019-nCoV, от малайских ящеров

bioRxiv

2020

Лам

TT

Шум

MH

Zhu

H

Идентификация коронавирусов, связанных с SARS-CoV-2, у малайских панголинов

Природа

2020

Wu

C-I

Поо

ММ

Моральный императив немедленного выпуска данных о последовательности 2019-nCoV

Национальная научная редакция

2020

7

719

20

Лю

-П

Jiang

J-Z

Wang

X

Являются ли панголины промежуточным хозяином нового коронавируса 2019 года (2019-nCoV)?

PLoS Патог

2020

16

e1008421

Лю

-П

Chen

W

Chen

JP

Вирусная метагеномика выявила вирус Сендай и коронавирусную инфекцию малайских панголинов (Manis javanica)

Вирусы

2019

11

979

Ян

Z

PAML 4: филогенетический анализ методом максимального правдоподобия

Мол Биол Эвол

2007

24

1586

91

Hanson

G

Коллер

J

Оптимальность кодонов, смещение и использование при трансляции и распаде мРНК

Nat Rev Mol Cell Biol

2018

19

20

30

Ван

Я

Shang

J

Graham

R

Распознавание рецепторов новым коронавирусом из Ухани: анализ, основанный на десятилетних структурных исследованиях SARS

J Virol

2020

94

e00127

20

Wrapp

D

Wang

N

Corbett

KS

Крио-ЭМ структура пика 2019-нКоВ в конформации до слияния

Наука

2020

367

1260

3

Ou

Х

Liu

Y

Lei

X

Характеристика спайкового гликопротеина SARS-CoV-2 при проникновении вируса и его иммунная перекрестная реактивность с спайковым гликопротеином SARS-CoV

Нац Коммуна

2020

11

1620

Qu

X-X

Hao

P

Song

X-J

Идентификация двух критических аминокислотных остатков шипового белка коронавируса тяжелого острого респираторного синдрома для его вариации при переходе к зоонозному тропизму с помощью стратегии двойной замены

J Biol Chem

2005

280

29588

95

Ren

Вт

Qu

X

Li

W

Разница в использовании рецепторов между коронавирусом тяжелого острого респираторного синдрома (SARS) и SARS-подобным коронавирусом, возникшим у летучих мышей

J Virol

2008

82

1899

907

Wu

Ф

Zhao

S

Yu

B

Новый коронавирус, связанный с респираторным заболеванием человека в Китае

Природа

2020

579

265

9

Цзи

Вт

Wang

W

Zhao

X

Гомологичная рекомбинация в спайковом гликопротеине недавно идентифицированного коронавируса может усилить межвидовую передачу от змеи к человеку

J Med Virol

2020

92

433

40

Чжао

Z

Li

H

Wu

X

Умеренная частота мутаций в геноме коронавируса SARS и ее последствия

BMC Evol Biol

2004

4

21

Чжан

С

Ван

М

Время возникновения и динамика эпидемии нового коронавируса 2019 года

bioRxiv

2020

Ю

W-B

Тан

G-D

Чжан

L

Corlett

RT

Расшифровка эволюции и передачи нового коронавируса пневмонии с использованием полных геномных данных

Zool Res

2020

41

247

57

Барретт

JC

Fry

B

Maller

J

Haploview: анализ и визуализация LD и карт гаплотипов

Биоинформатика

2005

21

263

5

Уотерсон

правая

Lander

ES

Wilson

RK

Исходная последовательность генома шимпанзе и сравнение с геномом человека

Nature

2005

437

69

87

Гиббс

RA

Rogers

J

Katze

MG

Эволюционные и биомедицинские исследования генома макаки резус

Наука

2007

316

222

Уотерстон

правая

Lindblad-Toh

K

Birney

E

Первоначальное секвенирование и сравнительный анализ генома мыши

Nature

2002

420

520

62

Грэм

RL

Sparks

JS

Eckerle

LD

Белки репликазы коронавируса SARS в патогенезе

Virus Res

2008

133

88

100

Ху

В

Zeng

L-P

Yang

X-L

Обнаружение богатого генофонда коронавирусов, связанных с SARS летучих мышей, позволяет по-новому взглянуть на происхождение коронавируса SARS

PLoS Pathog

2017

13

e1006698

Эдгар

RC

МЫШЦЫ: множественное выравнивание последовательностей с высокой точностью и высокой пропускной способностью

Nucleic Acids Res

2004

32

1792

7

Слейтер

GS

Бирней

E

Автоматизированная генерация эвристик для сравнения биологических последовательностей

BMC Bioinformatics

2005

6

31

Вернерссон

R

Педерсен

AG

RevTrans: множественное выравнивание кодирующей ДНК из выровненных аминокислотных последовательностей

Nucleic Acids Res

2003

31

3537

9

Кумар

S

Stecher

G

Li

M

MEGA X: анализ молекулярной эволюционной генетики на вычислительных платформах

Мол Биол Эвол

2018

35

1547

9

Гао

Ф

Chen

C

Arab

DA

EasyCodeML: визуальный инструмент для анализа выбора с использованием CodeML

Ecol Evol

2019

9

3891

8

Розас

Дж

Ferrer-Mata

A

Sanchez-DelBarrio

JC

DnaSP 6: анализ полиморфизма последовательности ДНК для больших наборов данных

Мол Биол Эвол

2017

34

3299

302

Ли

JW

Брайант

Д

popart: полнофункциональная программа для построения сети гаплотипов

Методы Ecol Evol

2015

6

1110

6

Стаматакис

А

RAxML версия 8: инструмент для филогенетического анализа и постанализа крупных филогений

Биоинформатика

2014

30

1312

3

Ли

H

Дурбин

R

Быстрое и точное согласование коротких считываний с преобразованием Барроуза-Уиллера

Биоинформатика

2009

25

1754

60

Ли

H

Handsaker

B

Wysoker

A

Формат выравнивания / отображения последовательностей и SAMtools

Биоинформатика

2009

25

2078

9

Sharp

PM

Li

WH

Использование кодонов в регуляторных генах у Escherichia coli не отражает отбор «редких» кодонов

Nucleic Acids Res

1986

14

7737

49

Заметки автора

© Автор (ы) 2020. Опубликовано Oxford University Press от имени China Science Publishing & Media Ltd.

Процесс литья под давлением, дефекты, пластик