Серия тд тпо расшифровка: Порядок оформления паспортов транспортных средств / КонсультантПлюс

Содержание

ПТС-паспорт транспортного средства

17.01.2013

ПТС – это основной документ на машину, который выдается на полнокомплектные автомототранспортные средства с рабочим объемом двигателя 50 куб. см и более и максимальной конструктивной скоростью 50 км/час и более, прицепы к ним и на шасси.

Аббревиатура ПТС расшифровывается как паспорт транспортного средства. Выдавать его может только таможня или завод-изготовитель транспортного средства.

Без правильно оформленного паспорта транспортного средства, автомобиль не допускается к участию в дорожном движении и не ставится на учет в ГИБДД.  Поэтому важно внимательно смотреть на наличие правильно заполненных полей.

Лицевая сторона ПТС

На лицевой стороне ПТС заполняются следующие данные:

  1. Идентификационный номер (VIN)
  2. Марка, модель ТС
  3. Наименование (тип ТС)
  4. Категория ТС (А, В, С, D, прицеп)
  5. Год изготовления ТС
  6. Модель, № двигателя
  7. Шасси (рама) №
  8. Кузов (кабина, прицеп) №
  9. Цвет кузова (кабины, прицепа)
  10.  Мощность двигателя, л.с. (кВт)
  11.  Рабочий объем двигателя, куб. см
  12. Тип двигателя
  13. Экологический класс
  14. Разрешенная максимальная масса, кг
  15. Масса без нагрузки, кг
  16. Организация-изготовитель ТС (страна)
  17. Одобрение типа ТС №
  18. Страна вывоза ТС №
  19. Серия, № ТД, ТПО
  20. Таможенные ограничения
  21. Наименование (ф. и. о.) собственника ТС
  22. Адрес
  23. Наименование организации, выдавшей паспорт
  24. Адрес
  25. Дата выдачи паспорта

При отсутствии значений каких-либо реквизитов или при невозможности их установить в соответствующих полях делается запись «отсутствует» или «не установлено». Оставление значений реквизитов незаполненными не допускается. Также не допускаются подчистки, приписки, зачеркнутые слова и цифры, а также проставление в строках прочерков.

Производимые в паспорте записи и подписи заверяются при необходимости, оттисками печатей с четко различимыми реквизитами.

Разделы, расположенные на оборотной стороне ПТС заполняются при совершении сделок, направленных на отчуждение и приобретение права собственности на транспортные средства.

Раздел Особые отметки

Данный раздел расположен в левой части ПТС и в нем указываются сведения, содержащие основания  оформления и выдачи паспорта. Например, выдача нового ПТС взамен утраченного, то в этом случае ставится отметка о предыдущих дубликатах или  же замена двигателя, что тоже должно быть отражено в поле «особые отметки». В общем, всё, что связано с изменением исходной информации, должно быть отражено уполномоченными на то лицами.

В связи с изменением законодательства, отмечу, что в поле «особые отметки» на машины, купленные после 1 сентября 2012 года и ввозимые через таможню, должна быть проставлена отметка об уплате утилизационного сбора, без которой машину не поставят на учет в ГИБДД.

Внесение изменений в регистрационные данные автомототранспортных средств или прицепов

О выдаче таможенными органами ПТС после 1 января 2017 года

Штраф за просроченную регистрацию авто

Что означают цифры в свидетельстве регистрации транспортного средства С/С-63 МТ 991602 1136 24, Ханты-Мансийск | вопрос №13851337 от 14.04.2022

Полная расшифровка информации, указанной в регистрационных документах на автомобиль дана здесь: Приказ МВД России N 496, Минпромэнерго России N 192, Минэкономразвития России N 134 от 23.06.2005 (ред. от 10.03.2017) «Об утверждении Положения о паспортах транспортных средств и паспортах шасси транспортных средств»

Порядок оформления паспортов транспортных средств

25. В строке «1. Идентификационный номер (VIN)» указываются арабскими цифрами и буквами латинского алфавита условные обозначения, присвоенные транспортному средству.

Первая часть VIN, позволяющая идентифицировать изготовителя транспортного средства, состоит из трех букв или букв и цифр, обозначающих географическую зону, код страны и код изготовителя транспортного средства, присвоенные в установленном порядке.

Вторая часть VIN является описательной частью идентификационного номера и состоит из шести знаков, обозначающих транспортное средство согласно конструкторской документации.

Третья часть VIN является указательной частью и состоит из восьми цифр или букв, из которых последние четыре знака должны быть цифрами. На первом знаке может указываться код года изготовления транспортного средства или модельного года в соответствии со Сравнительной таблицей цифр и букв, используемых в идентификационных номерах в качестве кода года изготовления транспортного средства или шасси транспортного средства (приложение N 2 к настоящему Положению), на последующих знаках — порядковый номер транспортного средства.

Для обозначения изготовителя, производящего менее 500 транспортных средств в год, в качестве третьего знака первой части VIN используют цифру 9. Для такого изготовителя комбинацию знаков, идентифицирующую конкретного изготовителя, проставляют на третьей, четвертой и пятой позициях третьей части VIN.

При наличии на транспортных средствах или шасси иных идентификационных номеров, имеющих отличное от VIN количество используемых букв и цифр (меньше 17), добавление каких-либо букв, цифр или символов не допускается.

26. В строке «2. Марка, модель ТС» указывается условное обозначение транспортного средства, присвоенное в порядке, установленном для изделий автомобильной промышленности, и приведенное в ОТТС, Свидетельстве либо в регистрационных документах и состоящее, как правило, из присвоенного транспортному средству буквенного, цифрового или смешанного обозначения, независимого от обозначения других транспортных средств.

27. В строке «3. Наименование (тип ТС)» указывается характеристика транспортного средства, определяемая его конструкторскими особенностями и назначением.

28. В строке «4. Категория ТС (А, В, С, D, прицеп)» указывается категория, которая соответствует классификации транспортных средств:

A — мотоциклы, мотороллеры и другие мототранспортные средства;

B — автомобили, разрешенная максимальная масса которых не превышает 3500 кг и число сидячих мест которых, помимо сиденья водителя, не превышает восьми;

C — автомобили, за исключением относящихся к категории «D», разрешенная максимальная масса которых превышает 3500 кг;

D — автомобили, предназначенные для перевозки пассажиров и имеющие более 8 сидячих мест, помимо сиденья водителя;

прицеп — транспортное средство, предназначенное для движения в составе с транспортным средством. Этот термин включает в себя полуприцепы.

Перевод категорий транспортных средств, указанных в ОТТС, Свидетельстве, в категории транспортных средств по классификации Конвенции о дорожном движении производится в соответствии со Сравнительной таблицей категорий транспортных средств (ТС) по классификации Комитета по внутреннему транспорту Европейской экономической комиссии ООН и по классификации Конвенции о дорожном движении (приложение N 3 к настоящему Положению).

(в ред. Приказа МВД России N 828, Минпромторга России N 1227, ФТС России N 1744 от 30.08.2012)

29. В строке «5. Год изготовления ТС» указывается год изготовления транспортного средства.

При отсутствии документального подтверждения даты изготовления транспортного средства год выпуска может определяться по коду изготовления, указанному в идентификационном номере транспортного средства.

30. В строке «6. Модель, N двигателя» указываются модель и присвоенный организацией или предпринимателем идентификационный номер двигателя, нанесенные на блоке двигателя. Идентификационный номер может состоять из групп раздельных цифр, из которых последняя группа, состоящая их двух цифр, указывает год изготовления двигателя.

31. В строках «7. Шасси (рама) N» и «8. Кузов (кабина, прицеп) N» указываются соответствующие идентификационные номера шасси (рамы) или кузова (прицепа), присвоенные и нанесенные на них организацией или предпринимателем.

32. В строке «9. Цвет кузова (кабины, прицепа)» указывается один из следующих основных цветов, нанесенных на наружные поверхности кузова (кабины) транспортного средства: белый, желтый, коричневый, красный, оранжевый, фиолетовый, синий, зеленый, черный или наименование иных цветов.

(в ред. Приказа МВД России N 26, Минпромторга России N 18, ФТС России N 80 от 19.01.2011)

В случае нанесения на наружные поверхности кузова (кабины) нескольких цветов в этой строке цвет указывается как комбинированный или многоцветный с названием основных цветов.

(в ред. Приказа МВД России N 26, Минпромторга России N 18, ФТС России N 80 от 19.01.2011)

33. В строке «10. Мощность двигателя, л.с. (кВт)» указывается мощность двигателя в лошадиных силах (киловаттах).

34. В строке «11. Рабочий объем двигателя, куб. см» указывается рабочий объем цилиндров двигателя.

35. В строке «12. Тип двигателя» указывается тип двигателя в зависимости от применяемого топлива.

36. В строке «13. Экологический класс» прописью указывается один из экологических классов, которому соответствует транспортное средство.

(в ред. Приказа МВД России N 828, Минпромторга России N 1227, ФТС России N 1744 от 30.08.2012)

При отсутствии в паспорте данной строки сведения об экологическом классе транспортного средства в раздел «Особые отметки» вносится запись: «Экологический класс (указывается номер экологического класса)».

37. В строке «14. Разрешенная максимальная масса, кг» указывается цифровое значение массы снаряженного транспортного средства с грузом, водителем и пассажирами, установленной организацией или предпринимателем в качестве максимально допустимой.

38. В строке «15. Масса без нагрузки, кг» указывается цифровое значение массы транспортного средства без нагрузки.

39. Сведения, предусмотренные в пунктах 33 — 38 настоящего Положения, заполняются на основании ОТТС, Свидетельства, а при их отсутствии соответствующие строки могут заполняться на основании официально изданных технических характеристик, справочников, таблиц и иных документов.

(в ред. Приказа МВД России N 828, Минпромторга России N 1227, ФТС России N 1744 от 30.08.2012)

40. В строке «16. Организация-изготовитель ТС (страна)» указываются полное или сокращенное наименование организации или предпринимателя, изготовившего транспортное средство, в том числе и как единичное транспортное средство, или фамилия, имя и отчество (отчество указывается при наличии) физического лица, изготовившего в Российской Федерации единичное транспортное средство в порядке индивидуального технического творчества, а в скобках указывается страна изготовления.

(п. 40 в ред. Приказа МВД России N 828, Минпромторга России N 1227, ФТС России N 1744 от 30.08.2012)

41. В строке «17. Одобрение типа ТС» указываются номер, под которым сведения об ОТТС или Свидетельстве включены в реестр, предусмотренный Техническим регламентом о безопасности колесных транспортных средств, дата выдачи ОТТС или Свидетельства и наименование органа по сертификации или испытательной лаборатории, оформивших указанные документы.

(п. 41 в ред. Приказа МВД России N 828, Минпромторга России N 1227, ФТС России N 1744 от 30.08.2012)

42. В строке «18. Страна вывоза» указывается страна, из которой транспортное средство было вывезено на территорию Российской Федерации.

Строка заполняется в случае ввоза транспортных средств в Российскую Федерацию из-за границы. В иных случаях в данной строке производится запись «отсутствует».

(в ред. Приказа МВД России N 1198, Минпромторга России N 463, ФТС России N 1700 от 31.12.2008)

43. В строке «19. Серия, N ТД, ТПО» указываются наименование документа (ТД или ТПО) и справочный номер из графы 7 ТД или справочный номер из графы 3 ТПО, по которым производилось таможенное оформление транспортных средств.

На транспортные средства, обращенные в федеральную собственность в установленном законодательством Российской Федерации порядке, либо при обращении взыскания на ввозимые в Российскую Федерацию транспортные средства по обязательствам их собственников, на которые паспорта были выданы таможенными органами в соответствии с пунктом 66 настоящего Положения, вместо ТД или ТПО может указываться иной документ, упомянутый в подпункте 66.2 настоящего Положения.

(в ред. Приказа МВД России N 828, Минпромторга России N 1227, ФТС России N 1744 от 30.08.2012)

44. В строке «20. Таможенные ограничения» указываются установленные таможенными органами в соответствии с законодательством Российской Федерации ограничения по пользованию и (или) распоряжению транспортными средствами, ввозимыми в Российскую Федерацию. Если ограничения не были установлены, в данной строке производится запись: «не установлены».

(в ред. Приказа МВД России N 828, Минпромторга России N 1227, ФТС России N 1744 от 30.08.2012)

45. В строке «21. Наименование (ф.и.о.) собственника ТС» указывается собственник транспортного средства, а в следующей строке «22. Адрес» — юридический адрес юридического лица или предпринимателя либо адрес регистрации по месту жительства (по месту пребывания) физического лица, являющихся собственниками транспортного средства.

(в ред. Приказа МВД России N 828, Минпромторга России N 1227, ФТС России N 1744 от 30.08.2012)

В случае выдачи паспортов на транспортные средства, отнесенные к единичным транспортным средствам, изготовленным в Российской Федерации или выпускаемым в обращение из числа ранее поставленных по государственному оборонному заказу, в строке «21. Наименование (ф.и.о.) собственника ТС» в качестве данных о собственнике указываются полное или сокращенное наименование организации, предпринимателя, фамилия, имя и отчество (отчество указывается при наличии) физического лица, являющихся изготовителями единичного транспортного средства, или открытое наименование собственника, эксплуатировавшего транспортное средство, ранее поставленное по государственному оборонному заказу.

(абзац введен Приказом МВД России N 828, Минпромторга России N 1227, ФТС России N 1744 от 30.08.2012)

46. В строке «23. Наименование организации, выдавшей паспорт» указываются организация или предприниматель, таможенный орган или подразделение Госавтоинспекции, выдавшие паспорт, а в следующей строке «24. Адрес» — их место нахождения.

47. В строке «25. Дата выдачи паспорта» указываются число, месяц и год выдачи паспорта.

48. В разделе «Подпись» проставляется подпись предпринимателя, должностного лица организации, таможенного органа или подразделения Госавтоинспекции.

49. В разделе «Место печати» проставляется оттиск печати (при наличии печати) организации, предпринимателя, подразделения Госавтоинспекции либо личной номерной печати должностного лица таможенного органа, выдавших паспорт.

Наименование (тип тс)

Тип ТС: легковой, грузовой и т.д., для легковых может быть указан тип кузова.

Год изготовление ТС

Год должен быть указан. Бывает, что вместо года указано «НЕ ОПРЕДЕЛЕН». Обычно такое может встречаться у «автомобилей-конструкторов».

Шасси (рама) №

Это только для рамных автомобилей (в основном для грузовиков или больших джипов).

Кузов (кабина, прицеп) №

Номер кузова обычно совпадает с VIN или его частью. Хотя это не правило.

(!) Пункты 10-25 должны быть заполнены обязательно (!)

Пункты: 16. Страна-изготовитель ТС, 17. Одобрение типа ТС, 18. Страна вывоза, 19. Серия, № ТД, ТПО — для автомобиля, ввезенного по всем правилам, заполнены всегда. Номер таможенной декларации состоит из трех групп цифр, разделенных слэшем ( «/» ). Для ТС, произведенных в Белоруссии (например, МАЗ’ов) вместо номера ТД указывается «без проведения таможенного оформления».

  1. ПТС

Паспорт транспортного средства — документ, содержащий сведения об основных технических характеристиках транспортного средства, идентификационные данные основных агрегатов, сведения о собственнике, постановке на учёт и снятии с учёта. В ПТС, как правило, указываются идентификационный номер (VIN), марка, модель, наименование и категория транспортного средства, год изготовления, модель и номер двигателя, номера шасси и кузова, цвет кузова, мощность и рабочий объём и тип двигателя, разрешённая максимальная масса, масса без нагрузки, а также сведения об изготовителе, страна вывоза и таможенные ограничения.

Паспорт транспортного средства заполняется и выдаётся на руки владельцу транспортного средства таможенными органами — в месте осуществления таможенного оформления, фирмой-продавцом (представителем завода-изготовителя) — при первой продаже транспортного средства и, в случаях, когда требуется выдача дубликата ПТС, — территориальными органами ГИБДД — по месту постановки транспортного средства на учёт.

Отличие настоящего птс

ПТС, как уже говорилось, выдается только таможней, о чем свидетельствует печать таможни в левом нижнем углу ПТС (в сложенном виде) и название таможни в пункте №22. Также должна быть подпись таможенника, оформлявшего ПТС — в правом нижнем углу (также может быть еще и личная печать таможенника, но сейчас это не обязательное требование). См. рис. 2.

Рис. 2. Пример оформления ПТС:

а — правильное б — неправильное

Номер и серия птс

Серия ПТС должна начинаться с буквы «Т» (это не касается иномарок, собираемых на заводах в России), например 77 ТК 123456 или 78 ТЕ 123456. Однако и тут не все просто: ПТС со номерами (указаны здесь) являются поддельными и их владельцам надо немедленно обращаться в ГИБДД (ГАИ). С 2008 года серия «Т*» закончилась и теперь ПТС имеют серию «У*». Также стоит обратить внимание на соответствие кода региона (первые 2 цифры перед буквами в номере ПТС) и региона, в котором был выдан ПТС. Недопустимо, что бы код региона был, скажем, 77 (Москва), а ПТС выдан, например, Оренбургской таможней. Единственное исключение, которое допускается, ПТС,выданный Центральной акцизной таможней (г.Москва) в 2007 году, может иметь серию 78. Это связано с тем, что ЦАТ открыла пункт пропуска в С-Пб и в 2007г они работают на питерских ПТС. Кроме того практически всегда текст в ПТС напечатан на принтере. «От руки» ПТС может быть выписан, но такое допустимо только в небольших городах. В крупных мегаполисах, таких как Москва Санкт-Петербург, Екатеринбург и т.д. все ПТС должны быть только напечатаны.

Рис. 3. Серия паспорта:

а — правильная

б – неправильная

В птс в серии латинские или русские буквы: информация с разъяснениями

Паспорт транспортного средства, наряду со свидетельством о регистрации, считается основным документом на автомобиль, который в обязательном порядке должен быть у собственника транспортного средства.

Дорогие читатели! Статья рассказывает о типовых способах решения юридических вопросов, но каждый случай индивидуален. Если вы хотите узнать, как решить именно Вашу проблему — обращайтесь к консультанту:

+7 (499) 938-81-90 (Москва)

+7 (812) 467-32-77 (Санкт-Петербург)

8 (800) 301-79-36 (Регионы)

ЗАЯВКИ И ЗВОНКИ ПРИНИМАЮТСЯ КРУГЛОСУТОЧНО и БЕЗ ВЫХОДНЫХ ДНЕЙ.

Это быстро и БЕСПЛАТНО!

Каждая бумага такого плана обладает индивидуальной серией и номером. Номера таким документам присваиваются в обязательном порядке, это нужно для учёта транспортных средств в электронном реестре, созданном автоинспекцией и налоговой службой.

Паспорт транспортного средства,в том числе и его дубликат, указывает регистрационные данные машины, в том числе информацию о марке и модели автомобиля, типе транспортного средства, годе выпуска, номере двигателя, номере кузова и шасси, цвете кузова, показателе мощности и рабочего объёма двигателя, разрешённой максимальной массе, массе без нагрузки, изготовителе, угон транспортного средства, техосмотр, таможня и др.

Вышеперечисленная информация, как и номер с серией, указаны на первой основной странице.

На развороте паспорта транспортного средства указываются все владельцы автомобиля, а именно:

  • фамилия, имя, отчество;
  • адрес регистрации собственника транспортного средства
  • данные (серия и номер, дата регистрации, кем выдано) свидетельства о регистрации.

В заключение информации о собственнике проставляется печать организации, которая осуществила запись о смене владельца.

На развороте паспорта транспортного средства имеется пункт «Особые отметки», в котором отмечаются причины замены документа и данные (серия и номер, дата выдачи) заменённого документа.

На последней странице паспорта транспортного средства посередине листа расположены серия и номер документа.

Паспорт транспортного средства считается главной и важной бумагой, которая доказывает право каждого собственника автомобиля на его владение.

С помощью этого документа производятся следующие операции:

  • учет всех эксплуатирующихся транспортных средств;
  • слежение и предотвращение противоправных действий сотрудниками полиции, связанные с транспортом;
  • контроль экологичности всех привезённых на территорию России транспортных средств со стороны таможенных инспекторов.

Как выглядит и где смотреть

Паспорт транспортного средства является документом, в котором описаны основные характеристики автомобиля и проставляются все предыдущие и настоящие собственники машины.

Документ печатается на государственном бланке, который считается защищённым от подделок посредством расположения на бумаге голограмм и водяных знаков.

Каждый бланк паспорта транспортного средства подлежит строжайшей отчётности и изготавливается на фабрике Гознак. Именно серия и номер позволяют вести отчётность и соблюдать контроль над выдачей каждого бланка.

Паспорт технического средства может быть выдан на транспортные средства:

  • легковой автомобиль;
  • грузовой автомобиль;
  • автобус;
  • прицеп грузового или легкового автомобиля, подлежащий отдельной регистрации;
  • шасси, которое входит в транспортное средство.

Заполнением паспорта транспортного средства занимаются следующие учреждения:

  • Межрайонный регистрационно-экзаменационный отдел (МРЭО) Государственной инспекции безопасности дорожного движения;
  • таможенное учреждение при ввозе автотранспорта на территорию Российской Федерации из-за границы;
  • завод-изготовитель при покупке транспортного средства с места производства.

Серия и номер паспортов транспортных средств указаны символами, имеющими красный цвет, которые расположены на первой и последней странице документа.

Если на первом листе серия и номер расположены сверху, то на последнем, символы находятся посередине листа.

Поле, в котором расположены символы, немного затемнено, что позволяет строке выделиться с помощью цвета на листе документа.

На каком языке буквы

Многих интересует вопрос о том, буквы русские или английские и латиница или кириллица? Паспорт транспортного средства, оформленный в Российской Федерации, имеет записи, напечатанные на русском языке.

Серия и номер документа не являются исключением. В серии документа содержатся как цифры, так и буквы. Буквенные символы указываются на русском языке.

Стоит понимать, что независимо от того, на каком языке указана серия паспорта транспортного средства, онлайн-сервисы, используемые для проверки автомобиля, требует внесения этих символов на английском языке.

Если после заполнения полей возникает неизвестная ошибка, возможно, следует сменить язык ввода серии паспорта транспортного средства и ввести данные заново.

Как восстановить ПТС на прицеп, рассказывается в статье: ПТС на прицеп. Как получить ПТС на мотоцикл, читайте здесь.

Буквы в птс русские или английские

Приведённая в данной статье информация касается только ПТС, выдаваемых в России! С 28.06.2021 в странах Таможенного союза начали выдавать электронные ПТС. Пока информации о ПТС выдаваемых вне территории РФ пока нет. Как только она появится, читайте третью часть серии статей о ПТС. А во второй части серии читайте о ПТС автомобилей, произведённых в России.

Пункты: 16. Страна-изготовитель ТС, 17. Одобрение типа ТС, 18. Страна вывоза, 19. Серия, № ТД, ТПО — для автомобиля, ввезенного по всем правилам, заполнены всегда. Номер таможенной декларации состоит из трех групп цифр, разделенных слэшем ( «/» ). Для ТС, произведенных в Белоруссии (например, МАЗ’ов) вместо номера ТД указывается «без проведения таможенного оформления».

Расшифровка серии и номера ПТС автомобиля

Серия паспорта транспортного средства представляет собой две цифры, которые обозначают код региона Российской Федерации, где был зарегистрирован автомобиль и выдан ПТС, и две буквы.

До 2008 года действовала серия документа, начинающаяся с буквы «Т», после этого, началась другая серия с первой буквой «У».

При покупке автомобиля, для того чтобы избежать покупки транспорта с поддельным паспортом транспортного средства, следует изучить код региона. Он должен совпадать с кодом района, в котором был выдан документ.

Заполнение паспорта транспортного средства не может производиться в письменном виде. Все характеристики, а также данные об автовладельцах пропечатываются в соответствующих строках, посредством принтера и компьютера, на котором установлена соответствующая программа для печати такого вида бумаги.

Стоит отметить, что код региона указывается только двумя цифрами. На сегодняшний день определены подделки бланков паспорта транспортного средства:

Транспортные средства, имеющие паспорта с вышеперечисленными сериями и номерами, не прошли оформления на таможне.

Использование и распоряжение такими автомобилями запрещено действующим законодательством, согласно ст. 131 Таможенного Кодекса РФ.

Однако, легальность транспортных средств, привезённых в Российскую Федерацию до 1996 года, определить в настоящий момент невозможно.

Но такие автомобили встречаются довольно редко. Кстати, до этого года паспорта транспортных средств выдавались государственной автомобильной инспекцией.

Стоит помнить, что код региона должен совпадать с адресом, указанным в строке 22 этого же документа. Обычно транспортное средство регистрируется в том отделении ГИБДД, на территории расположения которого проживает сам собственник автомобиля.

Буквы в русских номерах

Довольно редко можно встретить на улицах мегаполисов госномера на черном фоне, и довольно часто их имеет спецтехника. Благодаря этому можно легко догадаться о том, за какой структурой они закреплены. Это автомобили воинских частей МО, МВД, МЧС, и ФСБ.

До недавних пор по цифрам, размещаемым после трехзначного числа, можно было судить о регионе преимущественного использования автомобиля, или, по крайне мере, о регионе регистрации права собственности в базе ГИБДД. После введения изменений в законодательство смена номера при переходе права собственности не требуется, что позволило автомобилистам из регионов приобретать авто со столичными номерами и наоборот. Таким образом, на основании последнего числа в комбинации судить о том, откуда приехал конкретный автомобиль, нельзя.

Как правильно указывать в ОСАГО

Несмотря на то, что указание букв в ПТС происходит на русском языке, при оформлении полиса ОСАГО, следует вводить символы, используя латинскую раскладку.

При оформлении электронного полиса допускается и русская, и английская раскладка. Автоматическая система определит правильность набранной сери паспорта транспортного средства.

Однако, чтобы избежать непредвиденной ошибки, следует всё-таки вводить символы, используя латинскую раскладку.

Совпадают ли с СТС

Для того чтобы соблюдать удобство при ведении электронной базы автомобилей, бланки паспорта транспортного средства и свидетельства о регистрации выдаются в паре. Причём символы номера и серии имеют полное совпадение.

Этот факт помогает автовладельцу, имея на руках один из документов проверить наличие выписанных на транспортное средство штрафов. А также покупателю будет доступна история автомобиля при наличии серии или номера одной из бумаг.

Если сравнивать паспорт и свидетельство о регистрации транспорта, то основным отличием будет то, что первый документ не надо возить с собой водителю автомобиля, в отличие от второго, который при управлении транспортом должен быть всегда на виду у водителя.

Свидетельство о регистрации доказывает право на владение каждого автовладельца и доказывает инспектору ГИБДД, что именно определённый человек, указанный в этом документе, является собственником транспортного средства.

Если в документах водителя при проверке инспектором ДПС будет отсутствовать свидетельство о регистрации, то на водителя будет наложена административная ответственность и выписан соответствующий штраф.

Возможно, что при этом, транспортное средство отправится на специализированную штрафную стоянку.

Паспорт нужен при регистрации транспорта и оформлении страхового полиса КАСКО или ОСАГО на автомобиль. Возить с собой водителю при управлении автомобилем необязательно.

Кстати, паспорта транспортных средств, остаются в финансовой организации, выдавшей кредит на покупку автомобиля, до полного погашения долга.

РЕСО-ГАРАНТИЯ — отзывы о компании

Ранее страховался в другой СК, сейчас решил перейти в «Ресо-Гарантия». С трудом (за 2 дня), но мне удалось-таки оформить новый электронный полис (ЭП) ХХХ0000850057. Процесс при этом превратился в лабиринт, из которого можно выйти, имея железные нервы и достаточно времени для последовательного устранения допущенных ошибок. Анализируя свое «потерянное» время и гневные отзывы тех, кому достичь результата не удалось, прихожу к выводу, что большей части негатива можно было бы избежать. Для этого «Ресо-Гарантия» следовало бы изменить подход к процессу разработки, тестирования, внедрения программного обеспечения (ПО), обеспечивающего сбор, проверку данных и оформление ЭП. Пока, по-моему, это ПО не является дружелюбным к пользователям, не очень помогает клиентам и не подстраховывает их от ошибок. Желательно ПО доработать, а инструкцию по оформлению ЭП ОСАГО исправить и дополнить. Но, это отдельный разговор… Вызывает также вопросы достаточность мощности серверов и каналов связи при работе системы.

Для того чтобы облегчить процесс оформления нового ЭП другим клиентам СК, ниже укажу моменты, на которые рекомендую обратить внимание. Все написанное для тех, кто обладает ЛЕГКОВЫМИ автомобилями, и у кого в базе РСА нет серьезных ошибок в данных (для исправления ошибок надо обращаться с документами в офис СК). До начала работы с проектом ЭП приготовьте последний из оформленных полисов (ПОП) ОСАГО, ВУ на всех водителей, которых вы впишете в ЭП (см. ниже п.16), ПТС, и, на всякий случай, СР ТС и диагностическую карту. Рекомендую начинать оформление ЭП не менее чем за 25 дней до окончания срока действия прежнего. Тогда у вас будет время на консультации в техподдержке и устранение выявленных ошибок в данных. Итак: 1. Перед входом в «Личный кабинет» (ЛК) (https://client.res. ) найдите на экране слово «Инструкция». Откройте ее и скопируйте на жесткий диск. Если есть возможность – отпечатайте (хотя бы, шаги 6.1, 6.2, 7). Хотя эта инструкция неполная, и в ней есть ошибки, внимательное ее прочтение ДО работы с проектом ЭП, убережет от ряда проблем и сэкономит время. 2. После входа в ЛК начинайте заполнение реквизитов. В разделе «Параметры полиса ОСАГО» обратите внимание на логическое соответствие всех дат. Мне в одном из проектов расчета программа самопроизвольно изменила дату начала «Период использования 1», и эта дата стала более ранней, чем «Срок действия с». Я этого сразу не заметил и, естественно, этот проект расчета «вылетел». Периодически проверяйте ранее введенную в проект информацию. 3. В разделе «Страхователь» ничего менять нельзя. Пустые реквизиты в подразделе «Удостоверение личности» — «Дата выдачи», «Выдан» ни на что не влияют. 4. В разделе «Транспортное средство» выберите из выпадающих списков ваш вариант в реквизитах «Марка», «Модель», «по ПТС». Сверяйте все с ПТС. Если вдруг вашего варианта не окажется в списках, проверьте, как были указаны эти реквизиты в ПОП. В крайнем случае, опишите проблему (и, лучше, со сканом ПТС) запросите помощи в техподдержке – как именно вам указать в данном разделе ваш вариант. 5. Тип ТС программа определит автоматически. (Хотя, тип моей модели машины она назвала «Внедорожный (джип)», при этом и в ПТС и в СР ТС четко указано тип — «Легковой».) 6. Отметьте, при необходимости, использование прицепа. 7. Выберите из списка «Год выпуска». Для легкового автомобиля НЕ МЕНЯЙТЕ ничего в реквизитах «Количество пассажирских мест», «Разрешённая макс. масса, т», «Грузоподъемность, т». 8. Проставьте по ПТС «Мощность в л.с.». Если случилось «чудо», и в ПТС указана только мощность двигателя в кВт: уточните мощность для вашей модели в л.с. на сайте автопроизводителя; проверьте, как было указано в ПОП. Попробуйте ввести в проект найденное значение в л.с. В крайнем случае, обратитесь за советом в техподдержку, как указано в п.4. 9. Выберите ваш вариант расположения руля (хотя я не понял, зачем здесь эта информация для ОСАГО – может для ремонта после ДТП?). 10. При вводе VIN (17 символов) используйте заглавные латинские буквы и цифры. Не путайте латинскую букву «O» с цифрой «0». Если указали VIN, реквизит «Номер кузова / шасси» пропустите и ничего туда не вводите. Если VIN нет – укажите все реквизиты по ПТС. 11. «Рег. номер» вводите заглавными русскими буквами и цифрами. Не путайте русскую букву «О» с цифрой «0». 12. Выберите из списка «Цель использования ТС». 13. Перед вводом данных о ПТС и СР ТС, проверьте, какой из этих документов указан в разделе 2 ПОП. Данные именно этого документа и вводите в проект. При вводе серии ПТС используйте цифры и заглавные латинские (странновато, т.к. на самом ПТС в РФ серия указана с русскими буквами!) буквы. Не вводите серию в поле для номера ПТС и наоборот. 14. Если указали реквизиты для ПТС, реквизиты для «Свидетельство о регистрации» пропустите и ничего туда не вводите. 15. Если машина старше 3 лет, д.б. пройден ТО, с выдачей диагностической карты (ДК). В разделе «Технический осмотр» введите данные действующей ДК (номер и сроки действия). Желательно предварительно, на одном из сайтов, дающих возможность проверить наличие ДК в ЕАИС ТО (н-р, kbm-osago.ru›proverka-tehosmotra.html). Аккуратно перепишите оттуда 21 цифру номера ДК и сроки – их потом и внесите в проект ЭП. Такой путь необходим потому, что, например, у меня на бумажном экземпляре ДК указан 15-ти значный «Регистрационный номер», совершенно не совпадающий с 21-но значным номером этой же ДК в ЕАИС ТО. И, конечно, 15-ти значный номер проверку в проекте ЭП не прошел. 16. В разделе «Допущены к управлению» выберите свой вариант реквизита «Без ограничения». Если у вас «Ограниченный список», вводите ФИО без сокращений, серию и номер по ВУ (скорее всего, программа «пропустит» лишь тех водителей, которые были вписаны в ПОП). Рекомендую использовать для ввода ФИО и серии ВУ (если в серии есть буквы – не путайте букву «О» и цифру «0») заглавные русские буквы. Год выдачи первых ВУ (31.12.ХХХХ), если не проходит проверку, можно пытаться подобрать перебором. 17. Процесс оплаты и получения ЭП пояснений не требует. P.S. 18. Если программа зависает и появляется блок «Server Internal Error …» с текстом на английском языке (что странно — вообще-то, живем в русскоязычной стране!) с предложением о переподключении, не мучайтесь, сразу выходите из ЛК и начинайте повторную процедуру ввода данных в новый проект с «0». 19. Рекомендую работу по оформлению ЭП вести рано утром или в конце вечера. Возможно, собственники СК экономят на мощности серверов и каналов связи, и днем, из-за большого наплыва клиентов, происходит общий перегруз системы, отчего происходят ее сбои и «зависания». Утром и вечером нагрузка меньше, и шансов на нормальную работу системы больше.

Это интересно: Можно Ли Дистанционно Прописать Человека

Как узнать дату выдачи

Для того чтобы узнать дату выдачи паспорта транспорта, имея показатели серии и номера бумаги, можно воспользоваться несколькими способами:

  • лично или по телефону проконсультироваться у сотрудников ГИБДД, которые, воспользовавшись электронной базой транспортных средств, произведут проверку автомобиля и документа;
  • использовать официальный онлайн-сервис ГИБДД, который осуществляет поиск данных о транспортном средстве;
  • воспользоваться различными онлайн-страницами, предлагающими услугу получения сведений по серии и номеру паспорта автомобиля.

Посредством онлайн-сервисов, имея на руках паспорт транспорта, можно узнать информацию о самой машине (марка и модель, VIN, номер двигателя и шасси, массу транспортного средства, цвет, дата выпуска, производитель, государственный номер и показатель мощности двигателя).

Консультации по телефону предоставляются довольно редко. Скорей всего, для получения необходимой информации придётся проехать непосредственно в отделение ГИБДД.

Из вышеуказанного следует, что узнать как заполняется серия и номер птс не составит особого труда.

Как проверить ПТС по серии и номеру онлайн, показано в статье: проверить ПТС по серии и номеру онлайн. Как наказывается подделка подписи в ПТС, смотрите на странице.

Про перезалог авто под ПТС узнайте из этой информации.

Как получить дубликат паспорта транспортного средства?

П. 10 вышеназванного приказа также определяет порядок выдачи дубликата ПТС. Осуществляется эта процедура теми же субъектами, которые уполномочены выдавать паспорта в случаях, когда документ был утрачен по каким-либо причинам либо пришел в негодность.

Смотрите также: Как получить права – выбор автошколы, процесс обучения, сдача экзаменов

Тогда в новом паспорте в разделе «Особые отметки» производится запись следующего содержания: «Дубликат. Выдан взамен ПТС серия ХХХ № ХХХХХХ дата выдачи оригинала».

Важно: для некоторых органов также является обязательной отметка об утилизационном сборе.

Сама процедура замены ПТС идет в следующем порядке:

  • гражданин обращается в компетентный орган с заявлением и нужными документами;
  • происходит рассмотрение должностным лицом представленных бумаг;
  • происходит принятие решения.

Важно: как правило, замена ПТС осуществляется в тот же день, однако при исключительных обстоятельствах (проведения дополнительной проверки) срок может быть продлен до 30 суток.

Декодирование ЭЭГ показывает силу и временную динамику репрезентаций, релевантных цели

Поведение

Таблица 1 содержит среднее значение RT и частоту ошибок в зависимости от задачи и условий переключения. Мы подвергли RT повторным измерениям ANOVA с факторной задачей и переключением. Это дало скромный, но очень значимый эффект переключения, F (1,19) = 40,7, p  < 0,001, но без эффекта задания, F (1,19) = 0,03, p  0,8= 6 , и только маргинальная задача × взаимодействие с переключателем, F (1,19) = 3.33, p  = 0,08. Для частоты ошибок мы получили главный эффект для задачи, F (1,19) = 13,27, p  = 0,002, с более высокой частотой ошибок для цвета, чем для задачи ориентации, основной эффект для переключения, F (1,19) = 14,53, p  = 0,001, а также задание × взаимодействие переключателя, F (1,19) = 10,05, p  = 0,005, с несколько большей стоимостью переключателя цвета для задачи переключения цвета.

Таблица 1 RT и частота ошибок в зависимости от задачи и контраста переключения.

Стоимость переключения RT была относительно небольшой. Вероятно, это связано с двумя конструктивными факторами в нашей парадигме. Во-первых, чтобы разрешить моргание между испытаниями, мы использовали относительно длинный интервал ответ-стимул (RSI), который варьировался от 1450 до 1637 мс. Во-вторых, в отличие от более стандартной парадигмы переключения, где центральный стимул объединяет все аспекты, относящиеся к задаче, в текущей парадигме цель и дистракторы были пространственно разделены, чтобы можно было расшифровать расположение цели и дистрактора как аспекты, связанные с задачей.Учитывая пространственное разделение между целями и отвлекающими факторами, участники могли использовать пространственное внимание для уменьшения или даже устранения вызванных стимулом интерференций между задачами, что имеет решающее значение для получения больших затрат на переключение задач 33 .

По крайней мере, с точки зрения ошибок, задача ориентации была несколько проще, чем задача цвета, что может показаться удивительным, учитывая, что информация о цвете обычно более заметна, чем информация об ориентации/форме. Вероятно, это связано с тем, что различение левой и правой ориентации имеет совместимое отображение стимул-реакция (т.например, наклон вправо- > ответ вправо, наклон влево- > ответ влево), тогда как отображение отклика для цветовой задачи является произвольным.

Динамика репрезентации

На рисунке 1C показано, что точность декодирования развивается в соответствии со стандартными ожиданиями в отношении потока информации — от кодирования сигнала до активации установки внимания, к релевантным и нерелевантным местоположениям стимула и, наконец, к признакам. /коды ответов. Примечательно, что информация на уровне задачи (т. е. установка внимания) поддавалась декодированию с высокой точностью почти на протяжении всего испытания.

Чтобы убедиться, что наши выводы относительно декодирования теоретически важной функции задачи не скомпрометированы множественными сравнениями и ошибочными сравнениями со случайностью 34,35 , мы также провели тест перестановок на основе кластеров. Во-первых, мы сгенерировали серию t-значений с помощью t-тестов относительно уровня вероятности (33,3%), используя результаты декодирования со случайно перемешанными метками. Затем мы идентифицировали надежные кластеры как соседние моменты времени, которые превысили основной порог (порог определения кластера, альфа = 0.05) и сохранил размер максимального кластера. Мы вычислили значение кластера p- в соответствии с распределением перестановок статистики на уровне кластера (5000 перестановок), которое определило кластеры как значимые, если их размер был больше 95-го (т.е. альфа = 0,05) самого большого члена в распределении перестановок. В соответствии с этим анализом мы определили значительный кластер, расширяющийся от -260 до 500  мс для признака задачи (порог, определяющий кластер, p  < 0,05, скорректированный уровень значимости, p  < 0.001, критическая статистика = 52 мс).

Как упоминалось во введении, одна известная модель предполагает, что когнитивная система на самом деле не полагается на абстрактные настройки задачи, а — по крайней мере, когда они доступны — использует поверхностные репрезентации сигналов для устранения неоднозначности между конкурирующими репрезентациями стимула/реакции 4, 9 . Однако мы обнаружили, что точность декодирования сигнала (т. е. различение двух сигналов для каждой задачи) достигает пика в фазе до стимула, но резко снижается после предъявления стимула.Этот результат согласуется с мнением о том, что репрезентации сигналов используются для активации репрезентаций задач или установок внимания 5,27 и в меньшей степени связаны с фактическим регулированием процессов, специфичных для задачи.

Но как именно создаются наборы внимания? Если такие параметры имеют решающее значение для «предварительной настройки» процессов более низкого уровня, представления стимулов должны будут подождать, пока они не будут твердо установлены 11,12 . В качестве альтернативы наборы задач могут быть активированы параллельно низкоуровневым процессам выбора стимула/реакции, смещая их в направлении, соответствующем цели 3 .Как показано на рис. 1C, во время предстимульной фазы декодирование задачи было сверхслучайным, которое существенно увеличилось, когда информация о стимуле / ответе стала декодируемой. Таким образом, в то время как наличие предстимульной информации на уровне задачи указывает на некоторую роль предварительной конфигурации, общий паттерн предполагает, что — в соответствии с гипотезой параллельной активации — настройки внимания становятся особенно важными, когда необходимо устранить конкуренцию между конфликтующими репрезентациями стимула и реакции. разрешено (см.1Б).

Определение релевантности репрезентаций

Выходя за рамки средних траекторий активации, метод декодирования по каждому испытанию позволяет определить, на каком этапе испытания какой из представленных аспектов влияет на производительность. С этой целью мы ввели логит-преобразованные вероятности классификатора для пяти аспектов в качестве одновременных предикторов в линейную модель смешанных эффектов, предсказывающую RT для каждого испытания, со случайным прерыванием и случайными коэффициентами для каждого субъекта с использованием пакета lme4 36. .RT были предварительно отбелены путем удаления любых линейных или квадратичных трендов в блоках эксперимента. Коэффициенты, показанные на рис. 2А, представляют собой уникальную прогностическую силу, связанную с каждым аспектом, в зависимости от времени в испытании. Обратите внимание, что отрицательные коэффициенты подразумевают, что чем выше достоверность классификатора, тем быстрее RT, что указывает на то, что достоверность классификатора можно интерпретировать как репрезентативную силу. В соответствии с мнением о том, что репрезентации более низкого уровня контролируют установки внимания, а не поверхностные сигналы, мы обнаружили, что деятельность, связанная с сигналом, в значительной степени не имеет отношения к производительности, результат, который также сохраняется, когда в качестве единственного предиктора используется точность декодирования сигнала.Напротив, информация о наборе внимания стала в значительной степени предсказывать RT во время постстимульной фазы, предполагая, что колебания качества наборов внимания являются основным источником вариабельности результатов от испытания к испытанию. В соответствии с описанием параллельной активации, установки внимания начинают предсказывать RT только после того, как появляется (независимая) предсказательная сила информации о стимуле и реакции. Примечательно, что прогностический эффект для декодирования на уровне задачи выходит за рамки — также существенного — прогностического эффекта для целевого местоположения и аспекта характеристика/ответ.Более того, аспекты, которые, как мы не ожидаем, предсказывают производительность (например, сигнал и расположение отвлекающего фактора), не обнаруживают взаимосвязи. Этот результат исключает возможность того, что испытания с быстрым RT просто менее зашумлены и, следовательно, позволяют лучше декодировать любой аспект.

Мы также рассмотрели, в какой степени точность декодирования для различных аспектов связана с индивидуальными различиями в RT. Мы обнаружили, что временной паттерн простых корреляций между средней точностью декодирования отдельных лиц для каждого аспекта задачи и их средним RT был очень похож на паттерн внутри-индивидуального прогнозирования.Как показано на рис. 2B, точность декодирования для установок внимания была основным источником индивидуальных различий в RT в течение почти всего постстимульного периода, тогда как местоположение стимула коррелирует на ранней стадии, а аспект признак/реакция поздно в постстимульной фазе (рис. . 2Б). Кроме того, на рис. 2C показаны диаграммы рассеяния для корреляций при максимальной точности декодирования каждого аспекта задачи (см. рис. 1C). Примечательно, что, как и в случае отношений между испытаниями, отношения индивидуальных различий, по-видимому, выражают влияние конкретных функций на производительность, а не неспецифический фактор шума/декодируемости.Из-за небольшого размера выборки текущий эксперимент изначально не предназначался для изучения индивидуальных различий. Таким образом, эти анализы необходимо рассматривать как исследовательские и требуют повторения. Тем не менее уверенность в результатах подкрепляется тем фактом, что отношения поразительно устойчивы и, как с точки зрения вовлеченных признаков, так и с точки зрения их динамики во времени, в значительной степени согласуются с отношениями внутри индивидуума.

Взаимосвязь между репрезентациями

Представление о том, что подсказки активируют контрольные установки на уровне задачи, которые, в свою очередь, искажают репрезентации стимула и, в конечном итоге, реакции, приводит к прямому предсказанию последовательности, в которой различные репрезентации более низкого уровня должны быть связаны с силой настройки внимания.На рис. 3 для каждого момента времени представлены взаимосвязи между достоверностью классификатора для информации на уровне задачи и каждым из других аспектов (чтобы избежать беспорядка, мы опускаем здесь отвлекающий фактор, для которого взаимосвязь была близка к нулю). Как и ожидалось, в начале предстимульной фазы сила установок внимания сочеталась с силой репрезентации сигнала, что, вероятно, указывает на активацию установок внимания, основанных на сигнале 5 . После появления стимула возникла корреляция с целевым местоположением, а затем корреляция с ответной информацией.Этот паттерн снова согласуется с учетной записью параллельной активации, где установки внимания координируют репрезентации более низкого уровня параллельным образом (см. рис. 1B).

Эффекты переключения задач

В представленных до сих пор результатах мы игнорировали потенциальные эффекты смены задач от пробы к пробе, что обычно представляет большой интерес в исследованиях переключения задач 1 . На самом деле наша версия парадигмы переключения задач была оптимизирована для анализа декодирования ЭЭГ, а не для получения больших эффектов переключения (т.т. е. можно ожидать, что как использование длинных интервалов между испытаниями, так и пространственно разделенных, связанных с задачей признаков снизит конкуренцию между задачами). Действительно, затраты на изменение поведения были небольшими (см. Таблицу 1). Тем не менее, мы изучили, в какой степени контраст переключения/повторения проявляется в результатах декодирования. Мы заранее ограничили наш анализ интервалами в 150 мс, сосредоточенными вокруг пика траекторий активации для каждой функции (см. рис. 1C). Кроме того, учитывая сильную взаимосвязь между RT и точностью декодирования для задачи, местоположения стимула и ответа, мы также провели медианное разделение на испытания с быстрым и медленным RT.Медианное разделение проводилось по каждому предмету, задаче и состоянию переключения; Затем значения были усреднены по задачам и субъектам, но представлены отдельно для испытаний без переключения и с переключением. Доминирующим аспектом на рис. 4 снова является тесная связь между RT, с одной стороны, и задачей, целевым местоположением и репрезентациями ответа, с другой. Кроме того, переключение задач приводило к ослаблению представлений набора задач, как в целом (главный эффект переключения: F (1,19) = 6,69, p  = 0.018), но, в частности, в исследованиях медленной RT (быстрое/медленное × взаимодействие переключения: F (1,19) = 6,62, p  = 0,019). Кроме того, количество дистракторов было увеличено в испытаниях с переключением, F (1,19) = 5,23, p  = 0,034. Таким образом, во время пиковой активации установки внимания декодирование информации на уровне задачи было менее надежным при переключении, чем при испытаниях без переключения, тогда как информация, относящаяся к конкурирующей задаче, была выражена сильнее.

Насколько абстрактны установки внимания?

В нашей парадигме настройки внимания смешиваются с вниманием к различным визуальным особенностям (т.е., цвет против ориентации). Таким образом, результаты, о которых сообщалось до сих пор, не позволяют сделать однозначных выводов о том, в какой степени декодирование на уровне задачи отражает представления абстрактных правил задачи или задействование коррелированных с задачей сенсорных функций или характеристик, связанных с реакцией. Фактически, как показано в дополнительном материале, между задачами были отмечены различия во времени кодирования целевых местоположений, при этом декодирование цвета было более сильным и более ранним, чем декодирование ориентации. Возможно, даже если декодирование на уровне задач управляется такими аспектами, они все равно будут следствием нисходящих представлений на уровне задач и, таким образом, косвенно отражают силу нисходящего контроля посредством таких абстрактных представлений.Однако мы также можем провести дополнительный анализ, чтобы исследовать абстрактность информации, декодируемой на уровне задач.

В качестве первого шага мы проанализировали, как декодирование набора задач распространяется на критические аспекты стимула/реакции. Для этой цели мы разделили данные на четыре целевые позиции по двум бинам признаков/ответов (=8). Затем мы обучили классификаторы различать задачи для каждого из этих бинов и проверили на обобщение как с пропущенными испытаниями в исходном бине, так и для оставшихся семи бинов.Вставка на рис. 1C представляет временную динамику средней точности классификации внутри ячейки и точности классификации между ячейками (для каждой исходной ячейки, усредненной по всем семи ячейкам обобщения). Как видно, точность обобщающего анализа несколько снизилась, но осталась очень устойчивой. Этот результат подтверждает, что по крайней мере существенная часть декодируемой информации, относящейся к задаче, действительно имеет относительно абстрактный характер.

На втором этапе мы можем спросить, в какой степени предсказательная сила информации на уровне задач (см.2А) связан с абстрактной информацией, а не с коррелированными с задачами аспектами более низкого уровня. Таким образом, вместо достоверности классификатора набора задач мы использовали степень обобщения (см. вставку к рис. 1C) для прогнозирования RT. Как показано на вставке к рис. 2A, обобщаемый аспект декодированного представления на уровне задачи оставался надежным предиктором производительности. В дополнительном материале мы сообщаем о дополнительном анализе, в котором мы контролировали в прогностическом анализе (рис. 2A) степень, в которой представления более низкого уровня обобщаются для задач на основе испытаний за испытанием (см. рис.С3). Опять же, мы не обнаружили изменений в общей схеме прогнозирования, подтверждая, что декодированные представления набора задач были относительно абстрактными (рис. 4A).

Согласованность шаблонов декодирования задач

Мы использовали индивидуальный подход к декодированию, потому что у нас не было априорных прогнозов о полосах частот и местоположениях электродов, которые фиксируют информацию, специфичную для задачи. Тем не менее, было бы полезно знать, в какой степени такой индивидуальный подход действительно оправдан.Поэтому мы рассчитали для каждого субъекта, электрода и полосы частот мощность на протяжении 150 мс вокруг средней пиковой точности декодирования для наборов задач (см. рис. 1C) и сравнили их для двух задач. Затем мы сопоставили результирующий вектор из 80 (20 электродов × 4 полосы частот) t значений контраста задачи для каждого участника с вектором каждого другого участника. На рис. 5 показана гистограмма полученных корреляций; среднее значение составляет r  = 0,13 (вычисляется путем усреднения корреляций, преобразованных по оси z, и повторного преобразования среднего значения в коэффициент r ), а диапазон, хотя и с наклоном в положительном направлении, очень велик.Этот результат предполагает, что шаблон, разделяющий две задачи, довольно идиосинкразичен и, следовательно, оправдывает индивидуальный подход к декодированию.

Предубеждения направления движения и декодирование в зрительной коре человека

Наблюдатели.

В исследовании приняли участие пять наблюдателей (две женщины, возраст 24–32 года) с нормальным или скорректированным до нормального зрением. Один наблюдатель (O1) был автором. Наблюдатели предоставили письменное информированное согласие. Экспериментальный протокол соответствовал правилам безопасности для МРТ-исследований и был одобрен университетским комитетом по деятельности с участием человека в Нью-Йоркском университете.

Каждый наблюдатель участвовал в нескольких сеансах сканирования для нескольких экспериментов. Мы ссылаемся на эксперименты по форме апертуры стимула, потому что манипулирование формой апертуры имело решающее значение для интерпретации результатов. Четыре наблюдателя (O1–O4) участвовали в одном сеансе эксперимента «большое кольцо». Все пять наблюдателей участвовали в двух сеансах эксперимента «два круга». Один наблюдатель (O5) участвовал в третьем сеансе эксперимента с двумя кругами.В одном сеансе эксперимента «две полоски» участвовали три наблюдателя (О1–О3). Кроме того, все пять наблюдателей участвовали в одном сеансе для получения набора анатомических объемов с высоким разрешением и в одном сеансе для ретинотопического картирования.

Стимулы.

Стимулы были сгенерированы с использованием MATLAB (MathWorks) и MGL (http://gru.brain.riken.jp/doku.php/mgl/overview) на компьютере Macintosh. Стимулы отображались через ЖК-проектор (LC-XG250, Eiki, разрешение: 1024 × 768 пикселей, частота обновления: 60 Гц) на экран обратной проекции в отверстии магнита.Наблюдатели смотрели на дисплей через наклонное зеркало с расстояния обзора ~ 58 см (поле зрения: 31,6 ° × 23,7 °). Дисплей был откалиброван и скорректирован по гамме с использованием линеаризованной справочной таблицы.

Визуальные стимулы представляли собой движущиеся случайные точечные узоры (яркость: 583 кд/м 2 ; диаметр точки: 0,1°; плотность: 3 точки/° 2 ; скорость: 5°/с), представленные на однородном черном фоне . Точки имели время жизни 200 мс и случайным образом регенерировались на экране в конце их жизни.Точки, которые перемещались за пределы апертуры стимула, снова появлялись на противоположной стороне апертуры.

Эксперимент с большим кольцевым пространством.

Когерентно перемещающиеся точки были представлены в большом кольцевом отверстии с центром на фиксации (внутренний радиус: эксцентриситет 2°; внешний радиус: 11°; A ). Внутренний и внешний края кольца были скошены с приподнятым косинусным переходом на 2°. Косинусные переходы были центрированы на внутреннем и внешнем краях кольца, так что точки вблизи внутреннего края имели контраст 0 % при эксцентриситете 1° и контраст 100 % при эксцентриситете 3°, а точки вблизи внешнего края имели контраст 100 % при эксцентриситете 1°. 10° и контрастность 0% при 12°.В течение каждых 3 с точки перемещались в одном из восьми направлений (равномерно расположенных между 0° и 360°). Направление точек менялось на 45° каждые 3 секунды либо против часовой стрелки, либо по часовой стрелке, что занимало 24 секунды, чтобы завершить цикл. Стимул завершал 10,5 циклов в каждом прогоне. O1 совершил 18 пробежек; O2–O4 выполнили по 14 пробежек. Пробеги чередовались между направлениями вращения против часовой стрелки и по часовой стрелке, на каждое из которых приходилось половина пробегов.

Карты предпочтения стимулов и направлений для эксперимента с большим кольцом. A , Стимул циклически повторял восемь направлений движения за 24 с (здесь показаны все остальные направления). Фактический стимул содержал когерентные белые точки на черном фоне. Красные пунктирные кружки отмечают апертуру, в которой были представлены точки; они не появлялись в реальном стимуле. B , C , Карты предпочтения направления движения, отображаемые на уплощенных изображениях затылочных долей двух примеров наблюдателей (O1, B ; O2,

).Темно-серый цвет указывает на борозды; светло-серый, извилины. Плоские участки имеют приблизительный радиус 65–85 мм. Цвет указывает на фазу временного ряда ответа фМРТ каждого вокселя, которая соответствует предпочтительному направлению движения вокселя (см. цветную полосу и цветовой круг в A ). Белые контуры обозначают границы между зрительными областями коры. Вставка: раздутое полушарие одного наблюдателя, показывающее область коры, показанную на плоской карте. D , E , Точность декодирования движения как функция количества вокселей (случайно выбранных из каждой визуальной области; наблюдатель O1, D ; наблюдатель O2 E 9 9 ) .GM указывает на серое вещество. Планки погрешностей указывают на 95% доверительные интервалы (см. Материалы и методы, «Расшифровка направления движения»). Горизонтальные серые линии обозначают теоретическую вероятность вероятности (12,5%). F , Точность декодирования, усредненная по наблюдателям ( n = 4), показана отдельно для каждой области зрения. Столбики погрешностей указывают SEM для наблюдателей. Толстые и тонкие горизонтальные серые линии обозначают, соответственно, среднее значение и 95-й процентиль нулевого распределения точности декодирования (с поправкой Бонферрони для пяти ROI).

Эксперимент с двумя кругами.

Стимулы содержали два когерентно перемещающихся точечных поля слева и справа от фиксации ( A ). Каждое поле точек было представлено в круглой апертуре с эксцентриситетом 8°. Радиальный край каждой апертуры был сужен с приподнятым косинусным переходом на 3° (2,5–5,5° от центров апертур). В условиях «пустого фона» точки были представлены на черном фоне, как в эксперименте с большим кольцом ( B ).На краю каждой круглой апертуры контрастность точек менялась от 0% (черный фон) при радиусе 5,5° до 100% при радиусе 2,5°. В условиях «некогерентного фона» когерентные точки внутри апертур были окружены большим полем некогерентных точек, которое заполняло остальную часть экрана ( E ). Когерентность движения — это вероятность того, что точка будет назначена как «сигнальная» точка, которая двигалась в заданном направлении. Точка, которая не была сигнальной, была «шумовой» точкой, которая двигалась случайным образом; его местоположение смещалось в случайном направлении при каждом обновлении экрана (60 Гц).При 100% когерентности движения все точки были сигнальными точками, которые двигались когерентно; при <100% когерентности движения только часть точек двигалась когерентно. Точки переназначались как сигнал или шум случайным образом при каждом обновлении экрана. Края каждой круглой апертуры были сужены за счет изменения когерентности движения (а не контрастности), так что точки внутри каждой апертуры двигались со 100% когерентностью движения (все сигнальные точки), а точки за пределами апертур двигались с 0% когерентностью движения (все шумовые точки). ). По краям диафрагмы (2.5–5,5° от центров апертур) точки перешли от 100 % к 0 % когерентности движения.

Карты предпочтения стимулов и направлений для эксперимента с двумя кругами. A , Стимул циклически проходил через восемь равномерно расположенных направлений движения за 24 с (каждое другое направление показано здесь). Точки в левой и правой апертурах двигались в противоположных направлениях. B , Пустой фоновый стимул. C , D , Карты предпочтения направления движения для стимула пустого фона для двух примерных наблюдателей (O1, C ; O2, D

6 ).Плоские участки имеют приблизительный радиус 65–85 мм. Цвет указывает фазу временного ряда отклика фМРТ каждого вокселя, который соответствует предпочтительному направлению движения вокселя (см. цветную полосу и цветовой круг в A ). Вставки, увеличенное изображение фаз ответа V1. Смежный текст указывает ориентацию поля зрения участка: UVM, верхний вертикальный меридиан; LVM, нижний вертикальный меридиан. Здесь показаны только правые полушария, соответствующие левому зрительному полуполю (предпочтения направления в сером кружке A ).Левое полушарие было аналогичным. E , Некогерентный фоновый раздражитель. F , G , Карты предпочтения направления движения для некогерентного фонового стимула. Тот же формат и те же два наблюдателя, что и C и D .

В течение каждых 3 с точки внутри каждой апертуры перемещались в одном из восьми направлений (равномерно расположенные между 0° и 360°), но направления в левой и правой апертурах всегда были противоположны друг другу.Несовпадающее по фазе движение на противоположных сторонах фиксации помогло свести к минимуму возможность того, что наблюдатели допускали систематические ошибки фиксации (например, отслеживание движения глаз в направлении движения; см. «Измерения движения глаз»). Направления в обеих апертурах менялись по часовой стрелке или против часовой стрелки, для завершения цикла требовалось 24 с. Каждый запуск содержал 11 циклов. Прогоны чередовались против часовой стрелки и по часовой стрелке, а также между пустым и бессвязным фоном. O1–O4 завершили два сеанса, каждый из которых состоял из 12 прогонов, что дало в общей сложности 12 пустых фоновых прогонов и 12 бессвязных фоновых прогонов.O5 завершил третью сессию, состоящую из восьми прогонов, всего 16 прогонов на фоновое состояние.

Эксперимент с двумя полосками.

Когерентно движущиеся точки были представлены в пределах двух прямоугольных отверстий с острыми краями слева и справа от фиксации (см. A ). Длина каждой прямоугольной апертуры простиралась от 1° до 14° эксцентриситета вдоль горизонтального меридиана. Высота отверстия 3°, от 1,5° ниже до 1,5° выше горизонтального меридиана.

Эксперимент с двумя полосками. A , Стимул чередовал направления движения фовеа внутрь и фовеа наружу (по 9 с) в двух узких прямоугольных отверстиях слева и справа от фиксации. B , Курс времени отклика в V1 для примера наблюдателя. Светло-фиолетовая кривая представляет собой среднюю реакцию по вокселям вблизи внутреннего края стимула (эксцентриситет 1–2°; «внутренние воксели»). Темно-фиолетовая кривая указывает на воксели вблизи внешнего края стимула (эксцентриситет 10–14°, «внешние воксели»).Временной ход был усреднен по прогонам для этого наблюдателя и показан для 6,5 циклов чередования стимулов (половина продолжительности прогона). C , Амплитуда отклика как функция горизонтального эксцентриситета, рассчитанная путем проецирования временного ряда вокселей на синусоиду единичной нормы с фиксированной фазой (см. Материалы и методы, «Амплитуда отклика как функция расстояния»). Положительные значения указывают на предпочтение движения фовеа внутрь. Отрицательные значения указывают на предпочтение движения фовеа наружу.Фиолетовая кривая — V1. Красная кривая — МТ+. Кружки и планки погрешностей указывают среднее значение и стандартную ошибку среднего по наблюдателям соответственно ( n = 3). Серые вертикальные линии указывают внутренние и внешние края прямоугольных отверстий стимула вдоль горизонтального меридиана. D , Амплитуда ответа как функция коркового расстояния от центральной ямки. Тот же формат, что и C .

Точки внутри каждой апертуры перемещаются либо влево, либо вправо, к фиксации или от нее.В каждом прогоне точки чередовались каждые 9 с (18-секундные циклы) между перемещением внутрь и перемещением наружу: то есть точки в правой апертуре перемещались влево, а точки в левой апертуре перемещались вправо или наоборот. Каждый запуск содержал 14 циклов. O1–O3 завершили одну сессию, состоящую из 12 прогонов каждая.

Поведенческая задача.

На протяжении каждого прогона наблюдатели постоянно выполняли сложную двухэтапную задачу с принудительным выбором, чтобы поддерживать постоянное поведенческое состояние и стабильную фиксацию, а также отвлекать внимание от основных экспериментальных стимулов.В каждом испытании задачи фиксационный крестик (крестик 0,4°) тускнел дважды (на 400 мс за раз), и наблюдатель указывал нажатием кнопки интервал (1 или 2), в котором он был темнее. У наблюдателя была 1 с, чтобы отреагировать, и он получил обратную связь через изменение цвета фиксационного креста (правильный = зеленый, неправильный = красный). Каждому уменьшению контраста и периоду ответа предшествовал интервал в 800 мс, так что каждое испытание длилось 4,2 с. Задание на фиксацию не совпадало по фазе с предъявлением основного экспериментального стимула.Декременты контраста были представлены с использованием адаптивной лестничной процедуры 1-вверх-2-вниз (Levitt, 1971) для поддержания производительности примерно на 70% правильно.

Настройки направления движения.

Предпочтения направления движения были рассчитаны на основе среднего временного ряда отклика по циклам (после обращения во времени и смещения циклов по часовой стрелке для соответствия последовательности циклов против часовой стрелки; см. «Предварительная обработка временных рядов фМРТ»). Средние временные ряды каждого вокселя аппроксимировались синусоидой с периодом, соответствующим периоду стимульного цикла (24 с для экспериментов с большой апертурой и двумя кругами; 18 с для эксперимента с двумя полосками).Фаза наиболее подходящей синусоиды указывала на предпочтительное направление движения вокселя. Для каждого вокселя отношение сигнал-шум (SNR) ответов было количественно определено как корреляция между наиболее подходящей синусоидой и временным рядом (Engel et al., 1997). Эту величину обычно называют «когерентностью», но здесь мы обозначили ее как «SNR», чтобы отличить ее от когерентности движения.

Сходство карт.

Круговая корреляция (Jammalamadaka and SenGupta, 2001) использовалась для количественной оценки сходства между двумя наборами предпочтений направления для вокселей (например,) указывает круговое среднее по вокселям. R ( p 1 ± p 2 ) дает концентрацию угловой суммы (или разности) следующим образом:

, где ‖ — модуль комплексного числа. Значение r c колеблется от -1 до 1, и чем оно ближе к 1, тем сильнее связь между

p 1 и p 2 . Круговые корреляции между предпочтениями направления в экспериментах были рассчитаны для вокселей, которые попали в зону пересечения двух областей интересов (ROI), определенных функциональными локализаторами каждого эксперимента (см. «Функциональные локализаторы»).

Тест рандомизации использовался для оценки статистической значимости круговых корреляций. Значения фазы p 1 и p 2 были перетасованы (т. е. случайным образом переназначены разным вокселям), и между перемешанными значениями фазы была повторно вычислена круговая корреляция. Процесс был повторен 1000 раз, чтобы получить нулевое распределение круговых корреляций. Значение

p вычислялось как доля нулевого распределения, которая была меньше, чем наблюдаемая круговая корреляция без рандомизации.

Бутстрап-анализ был использован для определения того, существенно ли различаются две круговые корреляции, r c1 и r c2 . Сначала было получено бутстрепное распределение отдельно для r c1 и r c2 . Это было сделано путем повторной выборки вокселов с заменой, соответствующей парам значений фазы из p 1 и p 2 , вычислением круговой корреляции между значениями фазы перед выборкой и повторением процедуры 1000 раз.Во-вторых, мы вычислили разницу между парами значений начальной загрузки, соответствующих

r c1 и r c2 . Значение p соответствовало доле этих различий, которая была <0. Круговые корреляции r c1 и r c2 всегда вычислялись для одних и тех же вокселей, чтобы сделать их сопоставимыми; когда они включали разные эксперименты, корреляции пересчитывались на пересекающемся наборе вокселей.

Декодирование направления движения.

При многофакторном анализе данных фМРТ распределенный пространственный образец амплитуд ответа на конкретное условие стимула может быть описан как точка в многомерном пространстве, в котором каждое измерение представляет собой амплитуду ответа одного воксела. Точное декодирование возможно, когда ответы, соответствующие различным условиям, образуют отдельные кластеры в этом многомерном пространстве. Мы использовали классификатор для декодирования направления движения из ответов фМРТ, полученных в экспериментах с большим кольцом и двумя кругами.Классификационный анализ проводился отдельно для каждой ROI области зрения (см. «Ретинотопические карты» и «Функциональные локализаторы»).

Амплитуды ответов фМРТ измерялись для каждого вокселя, для каждого направления движения и для каждого запуска каждого эксперимента. Прогоны по часовой стрелке были обращены во времени, чтобы примерно соответствовать последовательности прогонов против часовой стрелки (см. «Предварительная обработка временных рядов фМРТ»). Амплитуды ответов затем оценивались путем усреднения по 10 циклам бега и усреднения по двум объемам (3 с), которые были собраны во время демонстрации определенного направления движения.Таким образом, каждый прогон давал восемь амплитуд отклика на воксель, соответствующих восьми направлениям движения. Для каждого эксперимента эти амплитуды отклика были суммированы по циклам, образуя матрицу n × м для каждой ROI, где м — количество вокселов в ROI, а n — количество повторных измерений (большие эксперимент с кольцом: n = 112 или 144, восемь направлений × 14 или 18 прогонов; эксперимент с двумя кругами: n = 96 или 128, восемь направлений × 12 или 16 прогонов).

Мы выполнили декодирование с помощью классификатора максимального правдоподобия, используя функцию «классифицировать» в MATLAB с опцией «diagLinear». Классификатор оптимально разделял ответы на каждое из восьми направлений движения, если вариабельность ответов в каждом вокселе была нормально распределенной и статистически независимой. Поскольку количество вокселей, м , было большим по сравнению с количеством измерений, n , вычисленная ковариационная матрица была бы плохой оценкой истинной ковариации.Это сделало бы работу классификатора нестабильной, поскольку он полагался на инверсию этой ковариационной матрицы. Поэтому мы проигнорировали ковариации между вокселами и смоделировали ответы как статистически независимые между вокселами. Хотя шум в соседних вокселах, вероятно, был коррелирован, предположение о независимости было консервативным; включение точных оценок ковариаций, если они доступны, повысило бы точность декодирования.

Процедура разделения пополам оценивала точность декодирования.Для каждого наблюдателя и каждой области интереса матрица ответов размером n × m была случайным образом разделена по размерности n (повторные измерения) на обучающую и тестовую выборки, каждая из которых содержала равное количество запусков. Данные в тренировочном и тестовом наборах были взяты из разных прогонов одного и того же сеанса и, таким образом, были статистически независимыми. Данные обучения использовались для оценки параметров классификатора. Точность декодирования определялась как доля правильных предсказаний для тестовых данных (восемь направлений движения × количество тестовых прогонов).Эта процедура декодирования повторялась после переразбиения данных. В случаях, когда количество запусков было относительно небольшим (например, 12 запусков для каждого из O1–O4 в эксперименте с двумя кругами), точность декодирования вычислялась для всех возможных перестановок разделения данных на обучающую и проверочную половины (924 перестановки). ). В других случаях, когда количество возможных перестановок превышало 1000, точность декодирования вычислялась для 1000 случайно выбранных перестановок. 2,5–97,5-й процентиль при повторных перекрестных проверках указывает 95% доверительный интервал точности декодирования.

Поскольку точность декодирования не имеет нормального распределения (например, она ограничена диапазоном от 0 до 100%), для определения статистической значимости точности декодирования был использован тест непараметрической рандомизации. В частности, мы построили распределение точности декодирования, ожидаемой при нулевой гипотезе об отсутствии связи между движением стимула и измеренными ответами. Чтобы сгенерировать это нулевое распределение, мы рассчитали рандомизированные по фазам временные ряды для каждого запуска и выполнили ту же процедуру декодирования с перекрестной проверкой для рандомизированных по фазам данных, что и для исходных данных (Freeman et al., 2011). Фазовая рандомизация временного ряда была вычислена путем взятия его преобразования Фурье, случайной перестановки его фазы Фурье без изменения амплитуды и инвертирования преобразования Фурье. Фазовая рандомизация сохранила временную автокорреляцию и спектр мощности ответов, но по-прежнему рандомизировала взаимосвязь между моментами времени и направлениями движения стимула. Повторение фазовой рандомизации 100 раз дало в общей сложности 92 400–100 000 точности декодирования на одного наблюдателя, ожидаемую при нулевом распределении.Среднее нулевое распределение по наблюдателям было получено путем вычисления нулевой точности декодирования для каждого наблюдателя и последующего усреднения нулевой точности декодирования по наблюдателям. Затем точность декодирования исходных данных считали статистически значимой, если она превышала 95-й процентиль нулевого распределения ( p < 0,05, критерий односторонней рандомизации). Нулевые распределения, вычисленные путем случайного перетасовывания меток направления движения и повторного вычисления точности декодирования, дали почти идентичные результаты.Там, где это было отмечено, использовалась поправка Бонферрони для корректировки множественных сравнений по ROI.

Предсказания внутрь диафрагмы.

Фазы отклика были предсказаны для эксперимента с двумя кругами, предполагая предпочтительное направление движения, направленное радиально к центру каждого кругового отверстия (с эксцентриситетом 8°). Для каждого воксела мы аналитически определили прогнозируемое предпочтение направления, используя предполагаемое ретинотопическое местоположение каждого вокселя, измеренное в независимых сеансах сканирования (см. «Ретинотопические карты»).В частности, для заданного местоположения поля зрения 90 135 x 90 136, 90 135 y 90 136 прогнозируемое предпочтение направления движения определялось следующим образом:

, где arctan( y , x ) — четырехквадрантный арктангенс, а θ L , R указывает локальное направление поля зрения влево или вправо. Чтобы преобразовать прогнозируемое предпочтение направления в фазу реакции и объединить данные по полушариям, мы добавили π к θ R (воксели в левом полушарии), поскольку стимулы в левой и правой апертурах двигались в противоположных направлениях.

Биннинг по предсказаниям апертуры внутрь.

В ходе этого анализа было определено, достаточно ли предпочтительного направления апертуры внутрь для декодирования движения. Для каждого вокселя мы аналитически вычислили фазу отклика, соответствующую предсказанию апертуры внутрь, используя предполагаемое ретинотопическое местоположение каждого вокселя. Каждому вокселу был назначен один из нескольких бинов, соответствующих диапазону прогнозируемых фаз отклика («ширина бина»). Временные ряды вокселов в каждом бине усреднялись, чтобы получить небольшое количество «супервокселей».Затем был проведен классификационный анализ полученных усредненных ответов для супервокселей. Классификация также выполнялась для вокселей, назначенных бинам случайным образом, а не на основе их предсказанных фаз отклика. Всю эту процедуру повторяли для ряда различных бинов ширины.

Амплитуда отклика в зависимости от расстояния.

Измерения, полученные в ходе эксперимента с двумя полосками, использовались для определения того, как амплитуды отклика изменялись в зависимости от расстояния от края апертуры.Поскольку стимул чередовался между внутренним и внешним движением относительно фиксации, ответ каждого вокселя отражал модуляцию активности, вызванную двумя типами стимулов. Чтобы измерить амплитуду этой модуляции, для каждого наблюдателя средний временной ряд (по прогонам) каждого вокселя был спроецирован (путем вычисления скалярного произведения) на синусоиду с единичной нормой. Синусоида имела период, соответствующий чередованию стимулов (18 с), и временную фазу π/2 (4,5 с; для аппроксимации гемодинамической задержки), так что пик синусоиды соответствовал по времени движению центральной ямки внутрь.Прогнозируемая амплитуда (Heeger et al., 1999) представляла собой значение со знаком, выделяющее компонент временного ряда, отражающий реакции на движение центральной ямки внутрь (положительное) и движение центральной ямки наружу (отрицательное). Если бы не было модуляции (одинаковый ответ на оба стимула), амплитуда была бы равна нулю. Этот анализ отличался от вычисления предпочтений направления для восьми стимулов движения: здесь мы воспользовались тем фактом, что ответы могут возникать только в двух фазах, разделенных π, и поэтому могут быть смоделированы как одна синусоида с фиксированной фазой.

Воксели были разделены на группы в соответствии с эксцентриситетом расположения их популяционного рецептивного поля (pRF). Затем ответы усреднялись по вокселям в каждом бине и усреднялись по наблюдателям. Использование разных размеров корзин дало аналогичные результаты. Воксели также были разбиты на группы в соответствии с их корковым расстоянием от центральной ямки. Это было сделано следующим образом. Для каждого наблюдателя мы определили небольшую область интереса (∼10–20 вокселей), соответствующую центральной ямке, отдельно для V1 и MT+ на основе измерений ретинотопии (см. «Ретинотопические карты»).Каждый воксел соответствовал «вершине» на поверхности коры. Для каждого вокселя в каждой области интереса зрительной области (V1 или MT+; см. «Функциональные локализаторы») мы рассчитали его кратчайшее расстояние на поверхности коры до каждого вокселя в соответствующей области интереса фовеа (Dijkstra, 1959) и усреднили по фовеальным вокселям. Для каждой визуальной области мера расстояния каждого вокселя затем вычиталась из наименьшей меры расстояния этой области, так что расстояние 0 соответствовало внутреннему краю стимула.Затем воксели зрительной зоны группировались в соответствии с расстоянием до них и усреднялись по наблюдателям.

МРТ.

Данные МРТ были получены на головном сканере Siemens 3T Allegra с использованием передающей головки (NM-011, Nova Medical) и восьмиканальной приемной катушки с фазированной решеткой (NMSC-071, Nova Medical). Для каждого наблюдателя была получена анатомия всего мозга с высоким разрешением путем совместной регистрации и усреднения трех Т1-взвешенных анатомических объемов (быстрое градиентное эхо с намагничиванием, или MPRAGE; TR: 2500 мс; TE: 3.93 мс; ФА: 8°; размер вокселя: 1 × 1 × 1 мм; размер сетки: 256 × 256 вокселей). Усредненный анатомический объем использовался для совместной регистрации сеансов сканирования, а также для сегментации серого вещества и уплощения коры. Функциональные сканы были получены с использованием Т2*-взвешенного градиентного эхопланарного изображения для измерения изменений интенсивности изображения, зависящих от уровня кислорода в крови (Ogawa et al., 1990). Функциональная визуализация проводилась с использованием 24 срезов, ориентированных перпендикулярно шпорной борозде и расположенных самым задним срезом на затылочном полюсе (TR: 1500 мс; TE: 30 мс; FA: 72°; размер вокселя: 2 × 2 × 2.5 мм; размер сетки: 104 × 80 вокселей). Анатомический объем MPRAGE с тем же профилем среза, что и функциональные изображения («в плоскости»), также был получен в начале каждого сеанса сканирования (TR: 1530 мс; TE: 3,8 мс; FA: 8°; размер вокселя: 1 × 1). × 2 мм с зазором между срезами 0,5 мм, размер сетки: 256 × 160 вокселей). Плоскостное анатомическое изображение было совмещено с анатомическим объемом высокого разрешения с использованием надежного алгоритма регистрации изображений (Nestares and Heeger, 2000).

Предварительная обработка временных рядов фМРТ.

Данные, полученные в начале каждого функционального цикла, были исключены, чтобы свести к минимуму влияние преходящей магнитной сатурации и позволить гемодинамическому ответу достичь устойчивого состояния: первый полупериод (большое кольцо, 8 объемов) или первый полный цикл (два круга, 16 объемов). томов; две полоски и тиражи локализатора, 12 томов) каждого тиража отбрасывали. Функциональные данные были компенсированы движением головы внутри и между сериями (Nestares and Heeger, 2000), линейно удалены от тренда и отфильтрованы по высоким частотам (отсечка: 0.01 Гц) для устранения низкочастотного шума и дрейфа (Smith et al., 1999). Временной ряд для каждого вокселя был разделен на его среднее значение для преобразования произвольных единиц интенсивности в процентное изменение интенсивности. Для экспериментов с большим кольцом и двумя кругами данные временных рядов из каждого запуска были сдвинуты назад во времени на 3 объема (4,5 с), чтобы приблизительно компенсировать гемодинамическое отставание. Для этих экспериментов временные ряды для прогонов по часовой стрелке были обращены во времени, чтобы соответствовать последовательности прогонов против часовой стрелки.

Ретинотопные карты.

Ретинотопия была измерена с использованием непериодических стимулов с бегущей полосой и проанализирована с использованием метода pRF (Demoulin and Wandell, 2008). Бары имели ширину 3° и пересекали поле зрения за развертки продолжительностью 24 или 30 с. Восемь различных конфигураций стержней (четыре ориентации и два направления перемещения) были представлены в случайном порядке в каждом прогоне. pRF каждого вокселя оценивался с использованием стандартных процедур подбора (Dumoulin and Wandell, 2008), реализованных в mrTools (http://www.cns.nyu.edu/heegerlab/?page=software). Границы визуальной области были нанесены вручную на плоских картах в соответствии с опубликованными правилами (Engel et al., 1997; Larsson and Heeger, 2006; Wandell et al., 2007). У четырех наблюдателей ретинотопия также измерялась с помощью периодически вращающихся клиньев и расширяющихся/сжимающихся колец и анализировалась с использованием обычного метода бегущей волны (Engel et al., 1994; Sereno et al., 1995; DeYoe et al., 1996; Engel et al., 1997; Larsson and Heeger, 2006), в результате чего были получены такие же определения области зрения, как и при использовании метода pRF.

Функциональные локализаторы.

Область зрения MT+ (включая как MT, так и MST) определяли путем измерения реакции на когерентно и некогерентно движущиеся точки. Затем MT и MST идентифицировали отдельно друг от друга по их топографической организации относительно соседних зрительных областей, полученных с помощью ретинотопического картирования (Huk et al., 2002; Smith et al., 2006; Gardner et al., 2008; Amano et al., 2009). Мы смогли с уверенностью идентифицировать MST только примерно в половине из 10 полушарий.Мы проводили все анализы отдельно для MT (во всех полушариях), для MST (для тех полушарий, в которых его можно было окончательно идентифицировать) и для MT+ (во всех полушариях). Результаты были схожими, подтверждая те же выводы (т. е. низкая точность декодирования, F , A , и аналогичные смещения фовеа внутрь, B , D , F ). Поэтому мы сгруппировали области MT и MST вместе и сообщаем результаты для MT+.

Смещение направления движения внутрь апертуры и внутрь фовеа. AD . Измеренная фаза отклика каждого воксела из эксперимента с двумя кругами (ордината) нанесена на график относительно фазы отклика, предсказанной предпочтением движения апертуры внутрь (абсцисса). Каждый круг представляет собой отдельный воксель. Данные были объединены по наблюдателям ( n = 5). Размер и цвет круга указывают ОСШ вокселя. Фазы отклика, соответствующие предпочтениям направления движения, определяются как в A . A , V1 пустое фоновое состояние. B , пустое фоновое состояние MT+. C , Некогерентное фоновое состояние V1. D , МТ+ некогерентное фоновое состояние. E , F , Средняя амплитуда ответа фМРТ как функция направления движения. Столбики погрешностей указывают SEM для наблюдателей ( n = 5). Синие и красные символы обозначают зрительные области левого и правого полушарий соответственно. Заполненные и пустые символы указывают на пустое и непоследовательное фоновое состояние соответственно. Е , В1. Ф , МТ+.

Декодирование движения для эксперимента с двумя кругами. A , Точность декодирования была усреднена среди наблюдателей ( n = 5) и показана отдельно для V1, V2, V3, MT+ и участка вокселей серого вещества (GM), которые не демонстрировали визуально вызванных ответов. Тот же формат, что и у F . B , C , Точность декодирования показана отдельно для каждой фазы отклика, определенной как в A .Каждая кривая указывает на ROI одной визуальной области. Цвет определяется как в A . Точность декодирования усреднялась по наблюдателям. Столбики погрешностей указывают SEM для наблюдателей. Горизонтальная серая линия указывает на точность случайного декодирования (12,5%). B , Пустой фон. C , Некогерентное фоновое состояние. D , Смещение внутрь апертуры и ОСШ предсказывают точность декодирования для разных наблюдателей. Каждый символ — это один наблюдатель ( n = 5).Кружки, треугольники, ромбы и квадраты обозначают V1, V2, V3 и MT+ соответственно. Закрашенные символы указывают на состояние пустого фона. Пустые символы указывают на некогерентное фоновое состояние. По оси абсцисс находится среднее угловое расстояние (ограниченное от 0 до π) между предпочтительным направлением каждого вокселя и предсказанием апертуры внутрь, усредненное по вокселям. Ордината — это среднее SNR по вокселям. Цвет указывает на точность декодирования.

Функциональные локализаторы использовались для ограничения каждой зрительной области только теми вокселами, ретинотопически соответствующими стимулам в каждом из основных экспериментов.Точки когерентно перемещались в течение 9 с, меняя направление случайным образом (на одно из восьми возможных направлений) каждую секунду. Через 9 с точки с экрана удалялись, и следующие 9 с наблюдатель видел только черный экран с фиксационным крестом. Этот цикл включения/выключения стимула повторялся 11 раз в каждом прогоне. Для эксперимента с большим кольцом и двумя полосками точки предъявлялись в тех же апертурах, что и для основного экспериментального стимула (т. е. большое кольцо и две прямоугольные полоски соответственно).В эксперименте с двумя кругами круглые отверстия, в которых были представлены точки, были аналогичны отверстиям в основном эксперименте, но с более узкой переходной областью по краям. В частности, каждое круглое отверстие было центрировано с эксцентриситетом 8° влево или вправо от фиксации, с радиусом, который расширялся от 4,5 до 5,5° при переходе контраста точки от 100% к 0%.

Для каждого наблюдателя и каждого функционального локализатора мы рассчитали средние временные ряды откликов по циклам. Средние временные ряды каждого вокселя аппроксимировались синусоидой, соответствующей периоду чередования стимулов (18 с; 9 с включено, 9 с выключено).Для каждого вокселя мы рассчитали корреляцию («SNR») между наиболее подходящей синусоидой и временным рядом (Engel et al., 1997) (см. «Предпочтения направления движения»). Мы определили активируемую стимулом область интереса для каждой зрительной области, ограничившись теми вокселами, которые превышали SNR > 0,4. Далее мы ограничили каждую область интереса, включив в нее только те воксели, для которых фаза наиболее подходящей синусоиды попала в интервал π, соответствующий фазе «включения» стимула.

Измерение движения глаз.

В подмножестве сеансов фМРТ (эксперимент с большим кольцом: каждый сеанс для всех четырех наблюдателей; эксперимент с двумя кругами: оба сеанса для O2–O4 и один сеанс для O5) мы измеряли положение глаз (500 Гц, монокуляр) с помощью инфракрасный видеотрекер для глаз (Eyelink 1000, SR Research). Необработанные положения взгляда были откалиброваны с использованием процедуры калибровки по девяти точкам и преобразованы в градусы угла зрения. Мигания были идентифицированы с помощью алгоритма обнаружения моргания Eyelink и удалены из данных о положении глаз вместе с образцами от 200 мс до до 350 мс после каждого интервала моргания.

Саккады были обнаружены с использованием установленного алгоритма (Engbert and Kliegl, 2003). Полная трассировка положения глаз в каждом прогоне (после удаления моргания) использовалась для установки порога скорости обнаружения саккад. Пороговый критерий обнаружения саккад определялся на основе двухмерной (горизонтальной и вертикальной) скорости движения глаз во время бега. В частности, мы установили порог в 7 раз больше стандартного отклонения скорости движения глаза в 2D, используя медианную оценку стандартного отклонения (Engbert and Kliegl, 2003).Саккаду идентифицировали, когда скорость движения глаз превышала этот порог в течение 8 мс (4 последовательных образца положения глаз). Мы также установили минимальный интервал между саккадами (между последней выборкой одной саккады и первой выборкой следующей саккады) в 10 мс, чтобы потенциальные коррекции выброса не считались новыми саккадами (Møller et al., 2002). Используя эти методы, мы показали ранее, что можем обнаруживать саккады размером до 0,1°, когда наблюдатели участвовали в аналогичном эксперименте фМРТ (Merriam et al., 2013). Большинство (98,5%) саккад, обнаруженных в настоящем исследовании, имели амплитуду менее 1°.

Образцы положения глаз и саккады были отдельно сегментированы и отнесены к 3-секундным периодам, соответствующим предъявлению каждого стимула. Саккады, которые происходили в эпохи, соответствующие одному и тому же направлению движения (эксперимент с большим кольцом) или фазе реакции (эксперимент с двумя кругами), были сгруппированы вместе, в результате чего для каждого эксперимента было получено восемь категорий саккад. Единая мера положения глаз (горизонтальное и вертикальное) была получена для каждой эпохи путем вычисления медианного положения глаз (во времени).Мы исключили из анализа положения глаз эпохи, которые содержали 1,5 с (из 3 с) или более отсутствующих выборок данных (например, чрезмерное моргание и некоторые прогоны, во время которых устройство отслеживания глаз было частично закрыто). Средние положения глаз для этих исключенных эпох, вероятно, были ненадежными (если пропущено более половины выборок) или вообще не могли быть оценены (если пропущены все выборки). Положения глаз и саккады были объединены отдельно по прогонам, сеансам и наблюдателям для каждого эксперимента, что дало ~ 4600 медианных положений глаз и ~ 15 000 саккад для эксперимента с большим кольцом и ~ 5400 медианных положений глаз и ~ 16 000 саккад для эксперимента с двумя кругами.

Расшифровка направления движения по движениям глаз.

Многомерный классификатор использовался для декодирования направления движения по положению глаз или вектору саккады, аналогично декодированию по воксельным ответам (см. «Расшифровка направления движения»). Для каждого эксперимента медианные горизонтальные и вертикальные положения глаз (в течение 3-секундной эпохи предъявления) были сложены по эпохам, образуя матрицу k × 2, где k соответствовало количеству эпох предъявления стимула (в прогонах, сессии и наблюдатели).Векторы саккад (горизонтальная и вертикальная амплитуды) также складывались для формирования матрицы с × 2, где с соответствовало количеству саккад (по эпохам презентации, прогонам, сеансам и наблюдателям). Для любого типа измерения движения глаз использовалась процедура разделения пополам для оценки точности декодирования. В частности, данные были разделены на тренировочную и тестовую половины. Мы обучили линейный классификатор двухмерным измерениям движения глаз на основе обучающих данных и использовали его для прогнозирования направлений движения для тестовых данных.2,5–97,5-й процентиль в 1000 повторных перекрестных проверках обеспечил 95% доверительный интервал точности декодирования. Для определения статистической значимости точности декодирования был использован тест непараметрической рандомизации, основанный на построении нулевого распределения точности декодирования. Нулевое распределение было сгенерировано путем случайной перестановки меток стимулов для положений глаз или саккад 1000 раз и каждый раз пересчитывая точность декодирования. Затем точность декодирования исходных данных считали статистически значимой, если она превышала 95-й процентиль нулевого распределения ( p < 0.05, односторонний тест рандомизации).

Анализ удаления саккад.

Чтобы определить, влияют ли различия в векторах саккад по направлениям движения на декодирование движения с помощью фМРТ, мы «удалили» вызванные саккадами ответы из временных рядов каждого вокселя перед повторным вычислением предпочтений направления движения и точности декодирования из остаточных ответов вокселей. В частности, для каждого прогона был построен вектор регрессора (при 500 Гц), соответствующий возникновению саккад в этом прогоне.Записи в векторе содержали 1 в момент времени, соответствующий началу каждой саккады, и 0 в противном случае. Регрессор был свернут с канонической гемодинамической функцией импульсного отклика (разность двух гамма-функций, также на частоте 500 Гц), дискретизирован до 0,67 Гц (соответствует 1,5 с TR) и подвергнут полосовой фильтрации с тем же фильтром, который использовался для временной ряд фМРТ. Этот результирующий вектор регрессора дал временной ряд, соответствующий предсказанному ответу, вызванному саккадами, для этого запуска.Этот прогнозируемый временной ряд был удален из исходного временного ряда каждого вокселя с помощью линейной проекции следующим образом:

, где x соответствовали прогнозируемому ответу, вызванному саккадами, y соответствовали исходному временному ряду, а r соответствовали результирующему остаточному временному ряду. Удаление с помощью проекции гарантировало, что остаточный временной ряд r был ортогонален удаленной составляющей x .

Декодирование визуальной информации из данных нейровизуализации диффузной оптической томографии высокой плотности

https://doi.org/10.1016/j.neuroimage.2020.117516Получить права и контент

Основные моменты

HD-DOT может поддерживать двоичное визуальное декодирование с высокой чувствительностью и специфичностью.

HD-DOT поддерживает детальное декодирование движущихся стимулов в отдельные моменты времени.

Декодирование HD-DOT воспроизводимо, хотя производительность может варьироваться в зависимости от участников.

Совместное декодирование также возможно с данными HD-DOT.

Abstract

Background

Нейронное декодирование может быть полезным во многих отношениях, от использования в качестве инструмента исследования неврологии до обеспечения средств расширенной коммуникации для пациентов с неврологическими заболеваниями. Однако применение декодирования в настоящее время ограничено ограничениями традиционных методов нейровизуализации. Электрокортикография требует инвазивной нейрохирургии, магнитно-резонансная томография (МРТ) слишком громоздка для ежедневного общения, а альтернативы, такие как функциональная спектроскопия ближнего инфракрасного диапазона (fNIRS), предлагают низкое качество изображения.Диффузная оптическая томография высокой плотности (HD-DOT) — это новый метод, в котором используются более плотные массивы оптодов, чем fNIRS, чтобы объединить логистические преимущества оптической нейровизуализации с улучшенным качеством изображения. Несмотря на то, что HD-DOT обещает облегчить полевые приложения нейровизуализации, расшифровку активности мозга, измеренную с помощью HD-DOT, еще предстоит оценить.

Цель

Оценить возможность и эффективность декодирования с помощью HD-DOT в зрительной коре.

Методы и результаты

Чтобы установить возможность декодирования на уровне одной попытки с помощью HD-DOT, была использована стратегия сопоставления шаблонов для декодирования положения визуального стимула.Анализ рабочих характеристик приемника (ROC) использовался для количественной оценки чувствительности, специфичности и воспроизводимости двоичного визуального декодирования. Наблюдались средние площади под кривой (AUC) более 0,97 за 10 сеансов визуализации у участника с большим количеством выборок. ROC-анализ декодирования у 5 участников установил как воспроизводимость у нескольких человек, так и возможность межиндивидуального декодирования (среднее значение AUC> 0,7), хотя эффективность декодирования различалась у разных людей.Для оценки более сложного недвоичного декодирования с помощью HD-DOT использовались фазово-кодированные стимулы шахматной доски. У 3 участников с высокой выборкой фаза шахматного клина шириной 60 °, вращающегося со скоростью 10 ° в секунду на 360 °, была декодирована с ошибкой внутри участника 25,8 ± 24,7 °. Декодирование между участниками также было возможно на основе проверки значимости на основе перестановок.

Выводы

Информация о зрительных стимулах может быть декодирована точно, воспроизводимо и с разной степенью детализации (как для бинарных, так и для небинарных результатов) на уровне единичного испытания (без необходимости усреднения данных по блокам) с использованием HD- данные ДОТ.Эти результаты закладывают основу для будущих исследований более сложного декодирования с помощью HD-DOT и применения в клинической популяции.

Ключевые слова

Ключевые слова

Декодирование

Диффузная оптическая томография

Функциональная нейромагистрация

Устойчивость

Устойчивость

Устойки

HD-DOT

Диффузная оптическая томография

FNIRS

Функциональная инфракрасная инфракрасная спектроскопия

FMRI

Функциональная магнитная резонансная визуализация

Рабочие характеристики приемника ROC

Рекомендуемые статьи

© 2021 Авторы.Опубликовано Elsevier Inc.

Поведенческие кластеры, выявленные сквозным декодированием микроэндоскопических изображений

Abstract

Визуализация кальция in vivo с использованием миниатюрных микроскопов, установленных на голове, позволяет отслеживать активность нейронных популяций в течение нескольких недель у свободно ведущих себя животных. Предыдущие исследования были сосредоточены на выводе поведения из популяции нейронов, однако выделить сигналы нейронов, учитывая расфокусированную флуоресценцию в эндоскопических данных, сложно.Существующие конвейеры анализа включают идентификацию областей интереса (ROI), что может привести к потере релевантной информации из-за ложноотрицательных результатов или внесению непреднамеренной систематической ошибки из-за ложноположительных результатов. Кроме того, эти методы часто требуют предварительных знаний для настройки параметров и требуют много времени для реализации. Здесь мы разрабатываем сквозной декодер для прогнозирования поведенческих переменных непосредственно из необработанных микроэндоскопических изображений. Наша структура требует небольшого пользовательского ввода и превосходит существующие декодеры, которым требуется извлечение ROI.Мы показываем, что остатки нейропиля/фона несут дополнительную релевантную для поведения информацию. Анализ видео также показывает оптимальное окно декодирования и динамику между остатками и ячейками. Важно отметить, что карты заметности показывают появление видеодекомпозиции в нашем декодере и определяют отдельные кластеры, представляющие разные поведенческие аспекты. Вместе мы представляем структуру, которая эффективна для декодирования поведения на основе микроэндоскопических изображений и может помочь обнаружить функциональную кластеризацию для различных исследований изображений.

1 Введение

Отслеживание активности больших популяций нейронов у бодрствующих и ведущих себя животных имеет решающее значение для понимания нейронных вычислений, лежащих в основе когнитивных функций. Недавние достижения в технологии визуализации in vivo кальция способствовали изучению нейронных цепей, лежащих в основе сенсорного восприятия (Glas et al., 2019; Mittmann et al., 2011; Rothschild et al., 2010; Wang et al., 2020; Yoshida). и Ohki, 2020), двигательный контроль (Ebina et al., 2018; Huber et al., 2012; Klaus et al., 2017), врожденное поведение (Betley et al., 2015; Evans et al., 2018; Jennings et al., 2015) и широкий спектр когнитивных форм поведения, таких как принятие решений (Harvey et al., 2012; Pinto and Dan, 2015; Tanimoto et al., 2017), а также обучение и память (Grewe et al., 2017; Roberts et al., 2017; Yu et al., 2017; Ziv et al., 2013). ). В частности, миниатюрная микроскопия с головным креплением в сочетании с микроэндоскопической линзой позволяет получить глубокое изображение мозга свободно движущихся животных (Cai et al., 2016; Флюсберг и др., 2008 г.; Гош и др., 2011). Хотя двухфотонные миниатюрные микроскопы (Helmchen et al., 2001; Sawinski et al., 2009; Zong et al., 2017) были разработаны для получения оптических срезов, они не получили столь широкого распространения из-за технических ограничений, в том числе более медленного скорость сбора данных, значительные артефакты движения и оптические ограничения волокон при передаче фемтосекундных лазерных импульсов с длиной волны 920 нм. С другой стороны, микроэндоскопическая визуализация с использованием однофотонного источника света страдает от больших фоновых флуктуаций из-за флуоресценции вне фокуса.На пути к достижению цели декодирования сенсорных стимулов или поведенческих переменных из записей, то, как правильно извлекать клеточные сигналы из этих низкоконтрастных изображений, было ключевым шагом в конвейерах анализа для визуализации кальция (Lu et al., 2018; Pnevmatikakis, 2019; Чжоу и др., 2018).

Типичный конвейер анализа (рис. 1a) включает следующие этапы: Во-первых, регистрация кадров изображения путем исправления артефактов движения. Часто движения мозга в поле зрения (FOV) могут быть нежесткими по всем направлениям и приводить к искажениям кадра.Для исправления этих артефактов движения применяется либо жесткий метод сопоставления с шаблоном (Dubbs et al., 2016; Kaifosh et al., 2014), либо нежесткий метод регистрации (Lu et al., 2018; Pnevmatikakis and Giovannucci, 2017). . Во-вторых, извлечение нейронных сигналов посредством оценки пространственных фильтров и соответствующих им временных трасс. Общие методы можно разделить на три класса: полуавтоматический анализ области интереса (ROI) (Klaus et al., 2017; Pinto and Dan, 2015), анализ основных компонентов/анализ независимых компонентов (PCA/ICA) (Mukamel et al. ., 2009; Reidl et al., 2007) и условной неотрицательной матричной факторизации (CNMFe) (Pnevmatikakis et al., 2016; Zhou et al., 2018). Затем вывод пиков времени из извлеченных следов флуоресценции. Чтобы упростить вывод спайков, следы флуоресценции можно рассматривать как последовательности спайков, свернутые с ядром с асимметричной кинематикой подъема и спада. Для решения этой проблемы деконволюции были предложены различные алгоритмы (Jewell and Witten, 2018; Pnevmatikakis et al., 2016; Vogelstein et al., 2010; Yaksi and Friedrich, 2006; Zhou et al., 2018).

Рис. 1: Типичные и предлагаемые конвейеры анализа данных однофотонной визуализации.

( a ) Типовой конвейер анализа. Данные сначала обрабатываются для удаления артефактов движения путем оценки поля движения из каждого кадра данных в шаблон ( наверх ). Из-за ограниченного осевого разрешения и низкого контраста в микроэндоскопической визуализации нейроны могут казаться пространственно перекрывающимися и часто требуют алгоритма декомпозиции видео, такого как CNMFe (см. Материалы и методы). После удаления фоновых сигналов извлекаются местоположения нейронов в поле зрения (FOV) и их активность ( в середине ).После этого по каждому следу флуоресценции можно сделать вывод о пиковой активности. Наконец, для расшифровки поведения животного использовались либо спайки, либо следы флуоресценции ( внизу ). Различные этапы конвейера отображаются на одном животном в нашем эксперименте. ( b ) Предлагаемый трубопровод. Поведение животных напрямую декодируется из необработанных фильмов после удаления артефактов движения.

Наконец, расшифровка поведенческих переменных или сенсорных стимулов либо из извлеченных следов флуоресценции, либо из предполагаемых последовательностей спайков.Общие декодеры, включая реконструкцию вектора популяции (Georgopoulos et al., 1986; Salinas and Abbott, 1994), фильтр Винера (Carmena et al., 2003), сопоставление шаблонов (Wilson and McNaughton, 1993; Zhang et al., 1998)), Байесовская парадигма (Браун и др., 1998; Сэнгер, 1996; Ву и др., 2006; Чжан и др., 1998) и модели машинного обучения (например, метод опорных векторов (SVM), k-ближайших соседей (kNN). ), линейный дискриминантный анализ Фишера (LDA), многослойный персептрон (MLP), рекуррентная нейронная сеть (RNN)) применялись в различных исследованиях (Glaser et al., 2020; Перейра и др., 2009 г.; Кирога и Панцери, 2009 г.).

Здесь мы предлагаем парадигму сквозного декодирования для прямого извлечения поведенческой информации из необработанных однофотонных микроэндоскопических данных (рис. 1b) и оценки с использованием проблемы прогнозирования кинематики на основе кальциевой визуализации CA1 гиппокампа у свободно кормящихся мышей (рис. 2а, б). Мы предполагаем, что нейропиль/фон, который был отброшен в большинстве конвейеров анализа, может кодировать положение и/или скорость животного. Вместо того, чтобы делать предположения о формате соответствующих сигналов, наша парадигма использует недавний прогресс в области глубокого обучения, чтобы определить, какие компоненты данных изображения являются наиболее информативными без необходимости сложной предварительной обработки.Наш декодер превосходит методы декодирования, использующие извлеченные нейронные сигналы. Результаты сравнивают кодирующую способность между предполагаемыми нейронами и фоновыми остатками и определяют вклад в различные моменты времени. Изучая карты важности, мы обнаруживаем, что декомпозиция видео естественным образом возникает в нашем декодере. Наши результаты предполагают, что нейропиль / фон являются дополнительным кодировщиком информации в микроэндоскопических записях и предоставляют новый способ идентификации нейронных ансамблей, представляющих различные аспекты пространственной навигации.

Рисунок 2: Точное декодирование положения и скорости бега по необработанным микроэндоскопическим изображениям.

( a-d ) Схема подготовки данных и архитектуры модели. Подробности см. в разделе «Материалы и методы». ( a ) Микроэндоскопическая визуализация СА1, экспрессирующего jGCaMP7f. ( b ) Пример исследовательского эксперимента в Н-образном лабиринте. Каждый лабиринт имеет длину около 1 м. ( c ) Положения животных ( x, y ) были выровнены по данным визуализации, уменьшены до 10 Гц, сглажены, а затем повернуты, чтобы уменьшить их корреляции.Наконец, позиции и скорости ( x, y, v ) были масштабированы до [-1, 1]. ( d ) Архитектура ConvNet. В каждый момент времени изображение передавалось в глубокую сеть, состоящую из двумерных сверточных слоев с активациями дырявого ReLU, за которыми следовали плотные слои с головкой регрессии для декодирования позиции ( x, y ) и мгновенной скоростью ( v ) животное. ( e ) Пример 10-секундных траекторий истинного (серый) и расшифрованного (черный) положений животного в эксперименте по исследованию □-лабиринта.Вверху: 10-секундная траектория движения животного. Внизу: 10-секундная траектория, когда животное было неподвижно или бежало со скоростью менее 5 см/с. ( f ) Декодированные переменные во времени в примере тестового набора. Серая линия обозначает истинные следы. Точки обозначают прогнозируемые трассы, окрашенные в зависимости от скорости бега. Средняя ошибка декодирования x, y и v: 7,84 см, 12,70 см, 6,23 см/с соответственно. ( g ) Производительность модели для всех наборов данных. Слева: наша модель ConvNet имела меньшую медианную ошибку в прогнозировании позиций (10.17 ± 0,43 см), чем базовые декодеры. Все они были выше уровня вероятности (48,57 ± 2,67 см; 90 135 p 90 136 < 1 90 135 e 90 136 - 5). Справа: скорость декодирования в нашей модели ConvNet (3,39 ± 0,14 см/с) была сравнима с декодером, обученным на нейронных сигналах (3,36 ± 0,14 см/с; 90 135 p 90 136 = 0,78), и лучше, чем у декодера, обученного на сигналах ROI ( 3,62 ± 0,18 см/с; р < 0,05). Все показатели были лучше, чем случайный уровень (4,66 ± 0,19 см/с; 90 135 p 90 136 < 1 90 135 e 90 136 - 5). ( h ) Распределение ошибок декодирования положения ( верх ) и скорости ( низ ) в примере набора данных по тестовым сгибам.Все значения p были получены с помощью знакового рангового критерия Уилкоксона.

2 Предыдущая работа

В типичном конвейере анализа то, как извлекаются и структурируются нейронные сигналы, является ключевым фактором, определяющим однофотонные микроэндоскопические данные. К сожалению, существующие методы извлечения исходного кода имеют несколько ограничений. Возьмем, к примеру, полуручной анализ ROI (Klaus et al., 2017; Pinto and Dan, 2015), загрязнение нейропиля из-за расфокусировки и рассеянной флуоресценции часто неадекватно удаляется и требует явных предположений о структуре нейропиля.Кроме того, сигналы пространственно перекрывающихся нейронов нельзя разделить. Кроме того, ручная аннотация области интереса может быть очень изменчивой из-за разногласий между маркировщиками и трудоемкой для крупномасштабных записей, в то время как пороговое значение карты активности, которая указывает изменения значения флуоресценции во времени для каждого пикселя, часто приводит к высокой частоте промахов для Обнаружение ROI. Что касается анализа PCA/ICA (Mukamel et al., 2009; Reidl et al., 2007), он игнорирует тот факт, что нейроны обычно имеют корреляции сигналов и корреляции шума (Averbeck et al., 2006). Более того, это линейный метод, и он не может должным образом разделить сигналы пространственно перекрывающихся нейронов. В последнее время CNMFe (Zhou et al., 2018) приобрел популярность благодаря своей превосходной способности демиксировать и шумоподавлять нейронные сигналы из микроэндоскопических данных. Однако это зависит от сложной настройки гиперпараметров, которая требует предварительных знаний о количестве нейронов и их размерах. Кроме того, он чувствителен к инициализации параметров и имеет неуникальные решения для идентификации ROI.В частности, все эти методы имеют ошибки обнаружения, которые приводят либо к введению дополнительной систематической ошибки, либо к отбрасыванию релевантной информации. Помимо вышеперечисленных проблем, эти алгоритмы часто требуют много времени.

В недавнем исследовании был разработан новый конвейер извлечения сигналов для однофотонной микроэндоскопической визуализации (MIN1PIPE) (Lu et al., 2018) для улучшения идентификации ROI. Благодаря включению двухкомпонентной гауссовской смешанной модели (GMM) и обученной рекуррентной нейронной сети (RNN) колебания, которые вряд ли могут быть переходными процессами кальция, удаляются, что приводит к очищенному набору начальных значений ROI.Этот метод уменьшает необходимость эвристической установки многих гиперпараметров. Однако это требует больших вычислительных ресурсов и требует дополнительных ручных оценок для обучения классификации переходных процессов кальция. Признавая сложность получения предварительно обработанных данных для декодирования, в другом исследовании была разработана Deepinsight (Frey et al., 2019), структура глубокого обучения, позволяющая делать выводы о поведении на основе широкополосных нейронных данных (например, необработанных записей электрофизиологии без сортировки спайков). Однако, когда дело доходит до данных визуализации кальция, это исследование по-прежнему требует извлечения временных трасс из идентифицированных областей интереса, прежде чем преобразовывать их в частотные представления, которые предоставляются декодеру в качестве входных данных.

Сквозной декодер широко используется во многих областях машинного обучения, но, насколько нам известно, никогда не применялся в области нейробиологии. Здесь мы стремимся напрямую извлекать поведенческую информацию из необработанных микроэндоскопических записей и изучать ее усвоенные представления.

3 Результаты

Чтобы оценить, насколько хорошо поведенческая информация может быть непосредственно извлечена из данных микроэндоскопической визуализации с помощью предложенной нами парадигмы декодирования (рис. 1b), мы экспрессировали индикатор Ca 2+ jGCaMP7f в дорсальном гиппокампе мышей, которым имплантировали линзу GRIN. прямо над областью СА1 (рис. 2а) и зафиксировали активность кальция в СА1 с помощью миниатюрного однофотонного микроскопа, прикрепленного к голове, в то время как животное свободно перемещалось по разным лабиринтам (рис. 2b и дополнительная рис. 1а).Данные визуализации и информация о поведении животного записывались одновременно, синхронизируясь с частотой дискретизации 30 Гц.

Чтобы сгенерировать необходимые входные данные и метки для модели декодера, мы сначала предварительно обработали поведенческие данные на следующих шагах. И изображения, и положение животных ( x,y ) были уменьшены до 10 Гц, чтобы уменьшить потребление памяти. Фильтр Савицкого-Голея применялся для сглаживания координат положения и получения скоростей бега ( v ). После этого координаты положения были повернуты, чтобы способствовать ортогонализации между выходными метками.Наконец, все переменные ( x, y, v ) были масштабированы до [-1, 1] (рис. 2c). Что касается входных изображений, поле зрения (FOV) было обрезано до 224 на 224 пикселя с масштабированием значений (см. Материалы и методы).

Перед обучением модели мы разделяем каждый набор данных на обучающий набор и тестовый набор. Разделив каждую сессию на пять последовательных периодов, мы выбрали один из них в качестве тестового набора. В литературе стратегия скользящего прогнозирования для разделения обучения/тестирования часто применяется к данным временных рядов, предполагая, что распределения не зависят от времени, что может быть неуместным, если животные меняют свои поведенческие признаки с течением времени.

3.1 Точное декодирование положения и скорости бега по необработанным микроэндоскопическим данным

Чтобы напрямую расшифровать положение и скорость бега животного по необработанным данным визуализации, мы построили модель сверточной регрессии (ConvNet) (рис. 2d). В каждый момент времени один кадр передавался в сеть, состоящую из двумерных сверточных слоев с активациями дырявого ReLU, за которыми следовали плотные слои. К последнему слою была применена операция Tanh. Гиперпараметры модели были найдены и определены на основе проверочного набора.Результаты показали, что наша модель ConvNet точно декодировала положение животных, а также скорость их бега из необработанных микроэндоскопических изображений в разных экспериментах (рис. 2e-h и дополнительный рисунок 2a-c). Путем сравнения производительности декодирования с нейронной сетью с прямой связью (FFNN), обученной на нейронных сигналах с шумоподавлением CNMFe, т. Е. FFNN (normG), и моделью, обученной на сигналах ROI с удаленным фоном, т. Е. FFNN (ROI) (см. Материалы и методы) , мы обнаружили, что с точки зрения прогнозирования позиций (рисунок 2g, слева) наша модель ConvNet имела меньшую медианную ошибку декодирования (10.17 ± 0,43 см), чем модель FFNN (ROI) (12,32 ± 0,72 см; ранговый критерий Вилкоксона: статистика = 54, 90 135 p 90 136 < 0,001) и модель FFNN (норма G) (10,74 ± 0,49 см; статистика = 135). , р < 0,05). Все эти модели были значительно лучше, чем случайный уровень (48,57 ± 2,67 см; 90 135 p 90 136 < 1 90 135 e 90 136 - 5). Что касается прогнозирования скорости бега (рис. 2g, справа), средняя ошибка декодирования нашей модели ConvNet (3,39 ± 0,14 см/с) была меньше, чем у модели FFNN (ROI) (3,62 ± 0,18 см/с; статистика = 121, 90 135). р < 0.05) и сравнимо с моделью FFNN(normG) (3,36 ± 0,14 см/с; статистика = 219, p = 0,78). Эти модели также были лучше, чем случайный уровень (4,66 ± 0,19 см/с; 90 135 p 90 136 < 1 90 135 e 90 136 - 5).

3.2 Остатки фона кодируют поведенческую информацию

Учитывая, что наша модель ConvNet, обученная на необработанных микроэндоскопических записях, была способна декодировать положения и скорости лучше, чем декодер, обученный на нейронных сигналах, извлеченных из CNMFe, мы выдвинули гипотезу, что остатки нейропиля/фона, часто отбрасываемые в визуализирующие исследования кодируют дополнительную поведенческую информацию, чем соматы клеток.

Чтобы оценить, сколько информации о поведении содержится в различных компонентах микроэндоскопической визуализации, мы создали несколько наборов изображений (рис. 3а), включая чистые изображения, состоящие только из соматических клеток, остаточные изображения, содержащие сигналы после вычитания сигналов нейронов из необработанных данных, и полые изображения. Изображения, на которых пространственные следы обнаруженных клеток были скрыты (см. Материалы и методы). Как показал пример набора тестов (рис. 3b), обе модели, обученные на необработанных и чистых изображениях, смогли декодировать поведенческие переменные ( x, y, v ) во времени.Удивительно, но модели, обученные на остаточных изображениях, все еще были способны предсказывать поведенческие следы (рис. 3б, в). Этот результат не был уникальным для одного набора тестов. Мы оценили все наборы данных из различных экспериментов по исследованию лабиринта (рис. 3d) и обнаружили, что позиции декодирования из остаточных изображений имели медианную ошибку (14,93 ± 1,04 см), сравнимую с декодированием из чистых изображений (11,03 ± 0,57 см; статистика = 165, p). = 0,16). Модели, обученные на Hollow ROI (13,46 ± 0,64 см) и Hollow A (15,13 ± 0,00 см).69 см) изображения имели значительно меньшую медианную ошибку декодирования, чем случайный уровень (48,57 ± 2,67 см; 90 135 p 90 136 < 1 90 135 e 90 136 - 5).

Рис. 3. Остатки нейропиля/фона кодируют поведенческую информацию.

( a ) Генерация данных для оценки информации, содержащейся в различных компонентах однофотонной визуализации кальция. Чистый: изображения, составленные только из нейронных сигналов с шумоподавлением. Остаток: Остатки от вычитания чистых изображений из необработанных. Полая область интереса: остатки с удаленной областью интереса.Пустота A: остатки с обнаруженными CNMFe следами клеток удалены. Подробности см. в разделе «Материалы и методы». ( b ) Примеры переменных, декодированных с использованием изображений, подготовленных в a из того же набора данных. Оранжевыми треугольниками отмечены моменты времени, когда мы можем легко увидеть различия в прогнозах между моделями. Серая линия обозначает истинные следы. Точки обозначают прогнозируемые трассы, окрашенные в зависимости от скорости бега. ( c ) Распределение ошибок положения (вверху) и скорости ( внизу ) декодирования в примере набора данных (такой же, как b ) по тестовым сгибам.( d ) Производительность модели для всех наборов данных. Вверху: декодирование позиций с использованием остаточных изображений (14,93 ± 1,04 см, синий) имело большую медианную ошибку, чем при использовании необработанных изображений (10,17 ± 0,43 см, зеленый; 90 135 p 90 136 < 0,01), но сравнимо с использованием чистых изображений (11,03 ± 0,57 см, оранжевый; р = 0,16). Оба изображения Hollow ROI (13,46 ± 0,64 см, розовый) и Hollow A (15,13 ± 0,69 см, салатовый) имели значительно меньшую медианную ошибку декодирования, чем уровень вероятности (48,57 ± 2,67 см; p < 1 e — 5) .Внизу: скорость декодирования с использованием остаточных изображений (3,66 ± 0,15 см/с, синий) имела большую медианную ошибку, чем при использовании необработанных изображений (3,39 ± 0,14 см/с, зеленый; 90 135 p 90 136 < 0,05), но в среднем такая же, как и при использовании чистых изображений. (3,54 ± 0,16 см/с, оранжевый; p = 0,46). Оба изображения Hollow ROI (3,63 ± 0,18 см/с, розовый) и Hollow A (3,78 ± 0,17 см/с, салатовый) имели значительно меньшую медианную ошибку декодирования, чем уровень вероятности (4,66 ± 0,18 см/с; p < 1 е — 5). Все значения p были получены с помощью знакового рангового критерия Уилкоксона.

Если бы не было дополнительной информации, встроенной в остатки по сравнению с идентифицированными нейронами, мы бы наблюдали аналогичную производительность декодирования между моделями, обученными на необработанных и чистых изображениях. Вместо этого декодирование позиций из необработанных изображений без исключения информации имело меньшую медианную ошибку (14,93 ± 1,04 см), чем декодирование из чистых изображений (11,03 ± 0,57 см; статистика = 102, p <0,01). В некоторых случаях модель, обученная на остаточных изображениях, могла декодировать позиции даже лучше, чем на чистых изображениях (например, при использовании чистых изображений).г., по наборам данных исследования H-лабиринта: Остаток: 10,87 ± 0,42 см, Чистый: 12,25 ± 0,43 см; статистика = 4, p < 0,05). Эти результаты предполагают, что дополнительная информация о местоположении может быть встроена в остатки нейропиля/фона.

3.3 Включение нескольких кадров во входные данные модели улучшает декодирование

Предыдущие результаты были декодированы и проверены на покадровом уровне. Учитывая относительно медленную динамику кальция, мы также предполагаем, что включение нескольких кадров во входные данные улучшает производительность декодирования.Чтобы проверить эту гипотезу, мы модифицировали архитектуру ConvNet, чтобы включить несколько кадров во входные данные (подробности см. в разделе «Материалы и методы»).

Когда не было ограничений на сверточные ядра, входные данные с 51 кадром исправили временное несоответствие в прогнозах по сравнению с однокадровым вводом (дополнительный рисунок 3a). Во всех наборах данных декодирование положения и скорости значительно улучшилось за счет включения нескольких кадров во входные данные (дополнительный рисунок 3b). В частности, использование 11 кадров (временное окно в 1 секунду) имело наименьшую медианную ошибку в прогнозировании положения (один кадр: 10.17 ± 0,43 см; 1-секундное временное окно: 7,50 ± 0,60 см; статистика = 5, p < 1 e − 5).

Далее мы модифицировали архитектуру, добавив ограничение на свертки во временном измерении (рис. 4а). В частности, каждый кадр проходил через один и тот же блок сверточных слоев, веса которых распределялись между кадрами. Путем изучения веса внимания, приписываемого этим кадрам, информация о поведенческом состоянии извлекалась из разных моментов времени. Наблюдалось аналогичное улучшение декодирования за счет включения нескольких кадров во входные данные (рис. 4b).Изучив распределение усвоенных весов внимания для ввода с 51 кадром, мы обнаружили, что кадр изображения больше всего способствовал декодированию поведенческого состояния с задержкой (рис. 4c), что позволяет предположить, что будущие кадры изображения несут больше информации о поведенческих состояниях животного.

Рис. 4. Включение нескольких кадров во входные данные модели улучшает декодирование.

( a ) Схематическая диаграмма ConvNet изменена для включения нескольких кадров во входные данные. Каждый кадр во входных данных проходит через блок сверточных слоев, весовые коэффициенты которых распределяются между кадрами, и генерирует специфичный для кадра признак (т.г., F T t , F T , и F T 90 9 3 9 1 3 1 +3 90). Слой внимания изучает веса, присвоенные кадрам в разные моменты времени во входных данных. В плотные слои вводится средневзвешенный признак ( F post ). ( b ) Примеры переменных, декодированных из одного и того же набора данных с использованием однокадрового ввода ( слева ) и 51 кадра ( справа ), когда свертки были общими для всех кадров.Оранжевые треугольники отмечают моменты времени, когда мы можем легко увидеть различия в прогнозах между моделями. Серая линия обозначает истинные следы. Точки обозначают прогнозируемые трассы, окрашенные в зависимости от скорости бега. ( c ) Распределение усвоенных весов внимания для ввода с 51 кадром (Δ t = ± 2,5 секунды).

3.4 Отдельные функциональные ансамбли идентифицируются по необработанным микроэндоскопическим изображениям

Одной из проблем при использовании модели глубокого обучения является интерпретация того, какие функции получены из данных.Наша модель ConvNet смогла декодировать кинематику животного, но было неясно, как декодер извлекал поведенческую информацию из микроэндоскопических изображений.

Чтобы понять, какая информация была извлечена из необработанных данных изображения, мы модифицировали алгоритм Grad-CAM (Selvaraju et al., 2017) для определения карт значимости в разных слоях модели (рис. 5а). В частности, карта важности целевой единицы в определенном слое оценивалась с помощью комбинации карт признаков, взвешенных по градиенту (подробности см. в разделе «Материалы и методы»).Если бы декодер ConvNet использовал прежнюю стратегию обучения, карты значимости продемонстрировали бы однородные рассеянные паттерны. С другой стороны, если использовалась последняя стратегия, карты значимости, вероятно, идентифицировали ансамбли, состоящие из различных комбинаций ячеек и фоновых признаков. Мы обнаружили, что на ранней стадии обучения глобальная фоновая флуоресценция уже была сегментирована от нейронных сигналов по слоям, а края кластеров клеток были частично обнаружены в средних сверточных слоях (рис. 5b, вверху).Когда модель была хорошо обучена (то есть после 26000 шагов), авторазложение возникло на разных слоях (рис. 5b, внизу). В частности, глобальные фоновые сигналы были сегментированы на ранних уровнях модели, но в более поздних слоях модели были идентифицированы отдельные ансамбли ячеек и фоновых признаков.

Рисунок 5: Появление автодекомпозиции и функциональных кластеров.

( a ) Схема адаптированного алгоритма Grad-CAM. Сначала мы применяем обратное распространение градиентов целевого фильтра на определенном слое к ближайшему предыдущему сверточному слою.Градиентно-взвешенная комбинация карт признаков, за которой следует операция ReLU, дает предполагаемую карту значимости. Подробности см. в разделе «Материалы и методы». ( b ) карты значимости для разных слоев модели. Каждый квадрат соответствует карте заметности типичного блока/фильтра в этом слое. Для каждого слоя был показан пример подмножества карт значимости. Вверху: когда модель была обучена только с 500 шагами, глобальная фоновая флуоресценция и сигналы от соматических клеток или локальных нейропилей уже были сегментированы по слоям, а края объектов были обнаружены на основе яркости в средних сверточных слоях.Внизу: когда модель была хорошо обучена, авторазложение возникло на разных слоях. В ранних сверточных слоях аналогичные глобальные фоновые сигналы были сегментированы, тогда как в более поздних сверточных слоях были идентифицированы разные области интереса. ( c ) карты значимости для разных слоев модели, когда выходные метки были назначены случайным образом. Образовался другой процесс разложения.

Кто-то может возразить, что сверточная модель может естественным образом обучаться идентификации объекта путем извлечения морфологических признаков изображения, поэтому возникающая декомпозиция по слоям модели является просто побочным продуктом сверточной нейронной сети.Чтобы проверить эту гипотезу, мы сравнили карты заметности в модели, в которой выходные метки были назначены случайным образом. Если бы гипотеза была верна, мы бы ожидали подобных карт заметности. Вместо этого был сформирован другой процесс декомпозиции, когда отношения между входными изображениями и выходными метками были удалены (рис. 5c), что позволяет предположить, что автодекомпозиция, появившаяся в декодере ConvNet, была функционально релевантной.

3.5 Дифференциальное кодирование топологии лабиринта по слоям

Следуя предыдущим выводам, декодер идентифицировал различные функциональные ансамбли.Далее мы исследовали, как топология лабиринта была представлена ​​в этих ансамблях. Предыдущие исследования показали, что внутренняя динамика нейронного ансамбля часто занимает низкоразмерное многообразие в многомерном пространстве состояний (Archer et al., 2014; Churchland et al., 2012; Cueva et al., 2020; Mante et al. др., 2013). Здесь нейронный ансамбль состоит из состояний активности искусственных единиц в декодере. Чтобы извлечь представления из посещаемых единиц на каждом уровне обученной модели, мы спроецировали их активность в двумерное пространство состояний с помощью Isomap (см. Материалы и методы).Чтобы дополнительно изучить, как топология лабиринта была изучена на разных уровнях модели ConvNet, мы сопоставили каждое нейронное состояние с истинным положением животного в лабиринте (рис. 6а, б). Когда модель была хорошо обучена (рис. 6а), спроецированная активность точно фиксировала пересечение и каждое ответвление лабиринта в средних слоях модели, несмотря на то, что расстояния между этими нейронными состояниями не могли отражать реальную топологию лабиринта. Однако на более поздних уровнях модели спроецированные нейронные состояния начали отражать реальную топологию лабиринта.Мы также визуализировали представления ансамбля на ранней стадии обучения, ошибка проверки которых была вдвое выше, чем у полностью обученной модели (рис. 6b), и показали, что эти представления ансамбля на ранних уровнях были определены на раннем этапе обучения, тогда как поведенческая топология была сформирована на более позднем этапе. слоев на протяжении всей тренировки.

Рисунок 6: Кодирование поведенческой топологии в многообразиях по слоям модели.

( a ) Представления ансамбля из разных слоев обученной модели в типичном наборе данных в экспериментах с Т-образным лабиринтом ( сверху ), Н-лабиринтом ( посередине ) и □-лабиринтом ( снизу ).Мы извлекли представления из посещаемых единиц на каждом уровне обученной модели и спроецировали их действия на двумерное пространство состояний с помощью Isomap. Каждая точка представляет поведенческое состояние, окрашенное истинным положением животного в лабиринте. 1-й столбец: Распределение позиций типичного животного. Другие столбцы: Топология позиций животных начала формироваться на более поздних слоях. Подробности см. в разделе «Материалы и методы». ( b ) Представления ансамбля из разных слоев модели на ранней стадии обучения, ошибка проверки которых была примерно в два раза.( c ) Сходство между нейронными многообразиями и поведенческой топологией. Сходство определялось как корреляция между парными расстояниями в нейронном многообразии и парными расстояниями в поведенческой топологии. Сходство значительно увеличилось от 6-го сверточного слоя к 7-му сверточному слою и еще больше увеличилось в последнем сверточном слое, а также в плотном слое в Т-образном лабиринте (фиолетовый), Н-лабиринте (золотой) и □-лабиринте (коричневый). ( d ) Сравнение нейронных многообразий в хорошо обученных моделях (черный цвет) и моделях, чьи ошибки проверки были примерно вдвое (серый цвет).Во всех наборах данных множественное сходство было значительно выше у обученных моделей (черные), чем у обучаемых моделей (серые) на более поздних уровнях (критерий знакового ранга Уилкоксона: статистика = 1, p < 1 e − 5, тогда как такие различие было менее значительным, но все же значительным на более ранних слоях (критерий знакового ранга Уилкоксона: статистика = 98, 90 135 p 90 136 < 0,05). в нейронном многообразии и попарных расстояниях в физическом лабиринте.Как показано на рисунках 6c и d, сходство между каждым нейронным коллектором и лабиринтом увеличивалось от ранних слоев к более поздним слоям обученной модели (Ранний: 0,03 ± 0,01; Conv6: 0,29 ± 0,03; Conv7: 0,67 ± 0,01; Последний : 0,87 ± 0,01; Плотный: 0,91 ± 0,01) и был значительно выше по сравнению с моделями на ранней стадии обучения (Ранний: 0,03 ± 0,01, статистика = 98, p <0,05; Conv6: 0,26 ± 0,03, статистика = 117, p = 0,05 Conv7: 0,57 ± 0,03, статистика = 102, p < 0.05; Последняя: 0,70 ± 0,03; Плотность: 0,74 ± 0,03, статистика = 1, p < 1 e — 5) в различных экспериментах по исследованию лабиринта.

В целом эти результаты показывают, что декодер представляет внутренние представления животного о лабиринте путем разложения топологии лабиринта по слоям.

4 Обсуждение

4.1 Эффект представления данных и архитектуры модели

После демонстрации того, что модель ConvNet может напрямую извлекать информацию о поведении из необработанных микроэндоскопических данных, мы оценили, как представление данных влияет на производительность декодирования.В идеале мы хотели бы, чтобы выходные метки аппроксимировали равномерное распределение для обучения модели глубокого обучения. Однако скорость бега животных была сильно смещена в сторону более низких значений. Мы применили логарифмическое преобразование скоростей (дополнительный рисунок 4a) и повторно обучили подмножество моделей. Результаты показали, что исходная ConvNet, обученная с линейными скоростями (11,49 ± 0,13 см), имела значительно меньшую медианную ошибку в прогнозировании позиций, чем та же архитектура, обученная с логарифмическими скоростями (12.45 ± 0,14 см; p < 1 e — 5) (дополнительный рисунок 4b, слева). Точно так же средняя ошибка в прогнозировании скорости бега была значительно ниже в исходной модели, обученной линейным скоростям (3,76 ± 0,03 см/с), чем в модели, обученной логарифмическим скоростям (3,95 ± 0,04 см/с; 90 135 p 90 136 < 1 90 135 e — 5) (дополнительный рисунок 4b, справа). Этот результат согласуется с исследованиями, предполагающими, что нейроны в гиппокампе кодируют скорость бега линейным образом (Góis and Tort, 2018; Kropff et al., 2015), отличается от представлений в логарифмической шкале в сенсорной коре (Nover et al., 2005).

Мы дополнительно оценили, как различные архитектуры моделей могут повлиять на производительность декодирования с нашими наборами данных. Первоначальная модель ConvNet предсказывала положение и скорость одновременно (дополнительный рисунок 5a, вверху). Мы предположили, что скоростное декодирование выиграло от совместной парадигмы обучения, а отдельная стратегия декодирования могла бы устранить эти преимущества. Мы модифицировали модель, чтобы иметь два отдельных декодера, один для положения, а другой для скорости (дополнительный рисунок 5a, внизу), и сравнили их производительность при прогнозировании положения и скорости бега животного (дополнительный рисунок 5b).Результаты показали, что модель с двумя отдельными декодерами улучшила предсказание положения (9,85 ± 0,42 см) по сравнению с исходной моделью с одновременным декодированием (10,17 ± 0,43 см; статистика = 133, 90 135 p 90 136 < 0,05), но за счет скорости. декодирования, т. е. его медианная ошибка (3,53 ± 0,16 см/с) была больше, чем у исходной модели (3,39 ± 0,14 см/с; stats = 131, p < 0,05).

Мы также провели перенос обучения с помощью модели ResNet-50 и модели MobileNet (дополнительный рисунок 6a), чьи параметры извлечения признаков были предварительно обучены ImageNet и заморожены во время обучения модели, тогда как параметры в плотных слоях были обновлены на протяжении обучение (см. Материалы и методы).Мы также создали нейронную сеть с прямой связью для извлечения признаков из необработанных микроэндоскопических изображений после максимального объединения (дополнительная фигура 6a). Эти архитектуры с различными комбинациями гиперпараметров были оценены на проверочном наборе. Обнаружено, что модель ConvNet имеет меньшую среднюю потерю L1 (0,1361), чем трансферное обучение с ResNet-50 (0,2370) или MobileNet (0,2617) (дополнительный рисунок 6b). Вероятно, это было связано с тем, что характеристики изображений ImageNet сильно отличались от наших записей.Другая причина заключалась в том, что эти модели компьютерного зрения были разработаны для обнаружения объектов, но нашей целью было не сегментирование нейронов, а извлечение встроенной временной информации. Удивительно, но несмотря на то, что в литературе было предложено нормализацию партии для повышения производительности модели, мы обнаружили, что наша модель без нормализации партии имела меньшие потери L1 (0,1361), чем при использовании нормализации партии (0,1450). Мы подозревали, что пакетная нормализация устранила флуктуации между образцами, которые могли содержать информацию о поведении, и, таким образом, поставила под угрозу производительность декодирования.

4.2 Как поведенческие состояния способствовали ошибкам декодирования

При сравнении эффективности декодирования мы сосредоточились на периодах, когда животные бежали со скоростью выше 5 см/с (БЕГ), поскольку предыдущие исследования показали, что нейроны гиппокампа имели очень разные профили реакции, когда животное отдыхало или двигалось с очень низкой скоростью (STOP) (Ahmed and Mehta, 2012; Davidson et al., 2009; Geisler et al., 2007; Ólafsdóttir et al., 2017). Действительно, когда обученную ConvNet оценивали по периодам STOP, декодированные траектории сильно отличались от истинных траекторий, как если бы животное мысленно имитировало бег (дополнительная фигура 7a, b).

Мы также исследовали нейронные коллекторы декодера в периоды STOP, чтобы оценить, как была представлена ​​топология лабиринта (дополнительная фигура 8a, b). Удивительно, но топология лабиринта не была полностью потеряна во время периодов СТОП. Вместо этого была зафиксирована глобальная топология лабиринта с нечеткими локальными структурами с уменьшенным сходством (Последний: 0,80 ± 0,02, статистика = 1, 90 135 p 90 136 < 0,001; Плотность: 0,86 ± 0,02, статистика = 5, 90 135 p 90 136 < 0,01) относительно к коллекторам в периоды RUN.

Тем не менее, эти результаты продемонстрировали, как внутренние состояния животного (например, бегает ли животное или нет) могут способствовать ошибкам декодирования. Можем ли мы использовать его в качестве инструмента для изучения воспроизведения гиппокампа, выходит за рамки этого исследования.

Что способствовало ошибкам декодирования в периодах RUN? Одной из распространенных причин было несоответствие между обучающими и тестовыми наборами. Чтобы оценить согласованность поведенческих переменных (90 135 x, y, v 90 136) между обучающими и тестовыми наборами, мы сравнили среднюю занятость и среднюю скорость в пространстве между обучающими и тестовыми наборами (дополнительный рисунок 1b и дополнительный рисунок 9a), на вычисление их двумерных корреляций ( r ).Результаты показали, что занятость и средняя скорость были в основном постоянными на протяжении всего сеанса, но снизились ближе к концу сеанса (в среднем r в Т-образном лабиринте: 0,71 ± 0,06, 0,74 ± 0,05, 0,78 ± 0,05, 0,76 ± 0,06, 0,71 ± 0,03; Н-лабиринт: 0,70 ± 0,03, 0,71 ± 0,02, 0,68 ± 0,06, 0,62 ± 0,04, 0,46 ± 0,13; □-лабиринт: 0,75 ± 0,03, 0,75 ± 0,03, 0,72 ± 0,03, 0,66 ± 0,05, .

Мы также количественно оценили сходство каждой парной переменной, вычислив показатель индекса структурного сходства (SSIM) между обучающим и тестовым наборами (дополнительная фигура 9b).Если два совместных распределения имеют одинаковую структуру, SSIM = 1. Мы обнаружили, что совместные распределения в экспериментах с Т-образным лабиринтом были самыми высокими, а совместные распределения оставались одинаковыми на протяжении всего сеанса во всех наборах данных (средний SSIM в Т-образном лабиринте: 0,82 ± 0,03). ; Н-лабиринт: 0,72 ± 0,02; □-лабиринт: 0,64 ± 0,04).

В целом, эти анализы показывают общую согласованность поведенческих переменных во времени, что позволяет предположить наличие других факторов, способствующих ошибкам декодирования. Одна из возможностей заключалась в том, что внутренний порог скорости бега различается у разных животных, так что некоторые периоды СТОП ошибочно принимались за периоды БЕГА, что приводило к ошибкам декодирования.Если бы это было так, мы бы наблюдали отрицательную корреляцию между ошибками декодирования и скоростью работы. Другой возможный источник ошибок декодирования связан с ограниченной временной точностью визуализации кальция. В этом случае мы бы наблюдали положительную корреляцию между ошибками декодирования и скоростью работы. Другой возможный фактор связан с систематической ошибкой выборки в обучающей выборке. Если бы имело место смещение в пространственной занятости, т. е. определенные позиции посещались животным больше, мы бы наблюдали смещение в прогнозах в отношении этих часто выбираемых позиций.

Для оценки этих факторов визуализировались места, где в лабиринте возникали ошибки декодирования, а также то, на что они указывали (дополнительный рисунок 10а), и сравнивались со средней заполненностью (плотность xy) и картами скорости (AvgSpeed) как в обучении, так и в тесте. наборы (дополнительный рисунок 10b). Возьмем в качестве примера сеанс исследования Т-образного лабиринта (дополнительный рисунок 10a, b), где указанная ошибка декодирования в основном коррелировала с картой AvgSpeed ​​обучающего набора ( r = 0,61) по сравнению с тестовым набором ( r = 0.51) и плотности x-y (тренировочный набор: r = 0,38; тестовый набор: r = 0,34). Напротив, место, где произошла ошибка декодирования, в основном коррелировало с картой AvgSpeed ​​тестового набора ( r = 0,81), относительно обучающего набора ( r = 0,62) и плотностью x-y (обучающий набор: r = 0,50). ; набор тестов: r = 0,52). Этот результат был одинаковым для всех моделей (дополнительная фигура 10c). Где обнаруженные неверные прогнозы больше коррелировали с картой AvgSpeed ​​тренировочного набора ( r = 0.56 ± 0,02; stats = 134, p < 0,05), в то время как место возникновения ошибки в основном коррелировало с картой AvgSpeed ​​тестового набора ( r = 0,78 ± 0,01, синий; ранговый критерий Уилкоксона: статистика = 1, p < 1 e − 5)

4.3 Информация, встроенная в фоновые остатки

Наши результаты показывают, что поведенческие переменные, такие как положение и скорость, могут быть напрямую декодированы из необработанных микроэндоскопических изображений без необходимости специфической идентификации предполагаемых нейронов и/или деконволюции. шипы.Наш подход, основанный на ConvNet, превосходит нейронную сеть с прямой связью, которая принимает в качестве входных данных шумовые следы кальция, предполагая, что нейропиль/фон, который фильтруется в типичном конвейере анализа кальция, кодирует поведенческую информацию. Можно возразить, что эта разница в производительности обусловлена ​​различной архитектурой декодера или входными параметрами. Однако, генерируя изображения, состоящие из изолированных компонентов фона и переднего плана, в качестве входных данных для декодера ConvNet, мы показали, что остаточные сигналы кодируют положение и скорость животного.Закрывая пространственные следы нейронов, при этом в основном оставались сигналы нейропиля, мы исключили возможность успешного декодирования как побочного продукта неполного извлечения источника в ROI. Наши результаты показывают, что нейропиль/фон при однофотонной визуализации кальция в CA1 гиппокампа содержит пространственную информацию.

Сигналы нейропиля считаются расфокусированными флуоресцентными сигналами от близлежащих клеточных процессов, включая дендритные шипики и сегменты аксонов (Gobel and Helmchen, 2007; Kerr et al.,2005; Ohki et al., 2005), и часто удаляются при анализе изображений кальция (Keemink et al., 2018; Lu et al., 2018; Pachitariu et al., 2017; Pnevmatikakis et al., 2016; Zhou et al. ., 2018). Тем не менее, исследования показали, что дендритная флуоресценция может демонстрировать переходные процессы кальция в ответ на синаптические входы, потенциалы действия обратного распространения и дендритные спайки (Kleindienst et al., 2011; Larkum et al., 1999; Svoboda et al., 1999; Takahashi et al. al., 2012; Yuste, Denk, 1995), которые важны для обработки информации.Например, дендритные спайки в сенсорной коре могут способствовать ориентационной избирательности (Euler et al., 2002; Sivyer, Williams, 2013; Smith et al., 2013) и угловой настройке (Lavzin et al., 2012). Кроме того, дендритные сигналы в СА1 могут модулировать поля мест и индуцировать новые образования полей мест для обеспечения избирательности признаков (Bittner et al., 2015; Sheffield and Dombeck, 2015).

Точно так же визуализация аксонов кальция показала, что отдельные аксоны могут кодировать переменные, связанные с задачей, такие как прикосновение и взмахивание руками (Petreanu et al., 2012). Вместе они предполагают, что сигналы нейропиля, включающие активность как дендритов, так и аксонов, кодируют внешние стимулы и поведенческую информацию. Эта гипотеза подтверждается нашими результатами, согласующимися с предыдущими исследованиями, которые демонстрируют, что как соматы клеток, так и участки нейропиля могут отражать целенаправленное поведение (Allen et al., 2017), а также ориентацию движущихся решеток (Lee et al., 2017). . Чтобы выделить в фоновых сигналах влияние дендритов, аксонов и соматических соматических клеток, находящихся вне фокуса, индикатор кальция, который специфически локализуется в соме (например,g., SomaGCaMP (Shemesh et al., 2020)) или аксон (например, аксон-GCaMP6 (Broussard et al., 2018)) потребуется для будущих экспериментов. В целом, наше исследование ставит под сомнение идею удаления фоновых сигналов из данных визуализации кальция и предлагает пересмотреть конвейер анализа для извлечения поведенческой информации из микроэндоскопических данных.

4.4 Вклад нашей парадигмы сквозного декодирования

В дополнение к раскрытию информации, встроенной в фон изображения, наша работа не требует сложной настройки гиперпараметров, требующей предварительных знаний, и обеспечивает простую в реализации структуру для поведения декодирования. из данных изображения.В литературе было предложено много методов для декодирования положения по активности группы одиночных нейронов в гиппокампе, но они требуют либо сортировки спайков для электрофизиологических записей (Brown et al., 1998; Wilson and McNaughton, 1993; Zhang et al. , 1998) или вывод пиков для данных визуализации кальция (Etter et al., 2020; Gonzalez et al., 2019; Shuman et al., 2020; Stefanini et al., 2020; Ziv et al., 2013). Хотя были разработаны альтернативные методы декодирования для визуализации кальция, чтобы обойти деконволюцию спайков, такие как непосредственная оценка частоты возбуждения нейронов (Ganmor et al., 2016), аппроксимация всплесков с отмеченным точечным процессом (Tu et al., 2020) или декодирование с использованием частотных представлений (Frey et al., 2019), все они требуют извлечения следов флуоресценции из идентифицированных отдельных нейронов. С другой стороны, разрабатываются новые статистические методы для декодирования положения с помощью несортированных спайков или потенциалов локального поля в электрофизиологии (Cao et al., 2019; Deng et al., 2015; Frey et al., 2019; Kloosterman et al., 2014). ). Однако эта идея никогда не применялась в однофотонной визуализации кальция.Это исследование является первой демонстрацией прямого декодирования поведения из необработанных микроэндоскопических данных без необходимости разделения сигналов отдельных нейронов.

Наш подход основан на силе глубокого обучения. Благодаря недавним достижениям в области машинного обучения были предприняты попытки использовать модели глубокого обучения, такие как рекуррентная нейронная сеть, для изучения скрытых функций из нейронных данных и декодирования поведения животных с высокой точностью (Glaser et al., 2020; Tampuu et al., 2019). ). Однако эти усилия по-прежнему основаны на идентификации отдельных нейронов и, к сожалению, не в полной мере используют методы глубокого обучения для извлечения информации из зашумленных данных.Наш сквозной декодер встраивает все этапы предварительной обработки в сеть. Кроме того, мы адаптировали алгоритм Grad-CAM (Selvaraju et al., 2017) для поиска карт значимости по слоям декодера. Мы выбрали Grad-CAM, учитывая его уменьшенные визуальные артефакты (Adebayo et al., 2018) и более плавные карты заметности по сравнению с другими подходами, такими как Vanilla Gradients (Simonyan et al., 2013), Guided Backpropagation (Springenberg et al., 2014) и Деконволюция (Zeiler and Fergus, 2014). Однако у этого метода есть ограничения по захвату мелких деталей.Тем не менее, наши результаты показали, что декомпозиция видео автоматически возникает в обученном декодере, и идентифицировали кластеры, состоящие из разных групп клеток и участков нейропиля для пространственных представлений в СА1. Эти результаты предлагают альтернативный способ классификации нейронной активности путем визуализации карт значимости декодера без необходимости запуска дополнительного алгоритма кластеризации.

В заключение мы (1) продемонстрировали эффективный и простой в реализации декодер необработанных микроэндоскопических данных, (2) выявили дополнительные поведенческие репрезентации, встроенные в фон нейропиля, и (3) предложили метод идентификации кластеров, релевантных для извлечения информация о положении и скорости в нейронных данных.Мы считаем, что наш анализ декодирования может быть расширен для изучения представлений других областей мозга, таких как энторинальная кора, первичная зрительная кора и теменная кора, лежащих в основе различных поведенческих задач, с потенциальными приложениями для декодирования в реальном времени и управления с обратной связью.

Вклад авторов

C.-J.C. и М.А.В. задумал проект; К.-Дж.К. разработал модели и эксперименты, проанализировал данные и написал код; В.Г. и Дж.Дж.З. предоставили данные о поведении животных и изображениях кальция; Дж.П.Н. разработанные методы сбора данных; WG реализовала алгоритм CNMFe и пометила данные; С.-Х.С. предоставил консультацию по инфраструктуре Tensorflow; C.-J.C подготовил рукопись; M.A.W. курировал проект. Все авторы участвовали в редактировании рукописи.

Дополнительные рисунки

Дополнительный рисунок 1: Примеры поведения исследования в Н-образном, Т-образном и □-лабиринте.

( a ) Схематические диаграммы Н-образного лабиринта ( вверху ), Т-образного лабиринта ( посередине ) и □-лабиринта ( внизу ) исследовательских экспериментов.( b ) Оценка разделения поезд/тест для каждого исследования лабиринта. Слева: кумулятивная функция плотности (CDF) каждой метки между обучающими и тестовыми наборами. Справа: средняя заполняемость (плотность x-y) и карты скорости (AvgSpeed) для типичного разделения поезд/испытание. Для примера набора данных H-лабиринта, T-лабиринта и □-лабиринта его двумерная корреляция между обучающими и тестовыми наборами: r(x-y Density) = 0,7230, 0,9154 и 0,5232 соответственно; r(AvgSpeed) = 0,7678, 0,7379 и 0,6612 соответственно.

Дополнительный рисунок 2: Примеры декодированных следов бега в Т-образном и Н-лабиринте.

( a ) Вверху: пример 10-секундной траектории животного в эксперименте по исследованию Т-образного лабиринта. Внизу: пример 10-секундной траектории животного в исследовательском эксперименте в Н-образном лабиринте. ( b ) Декодированные переменные во времени в тестовом наборе T-образного лабиринта. Средняя ошибка декодирования x, y и v: 2,95 см, 6,15 см, 3,12 см/с соответственно. ( c ) Декодированные переменные во времени в примере тестового набора Н-лабиринта. Средняя ошибка декодирования x, y и v: 5,53 см, 9,94 см, 3,65 см/с соответственно.

Дополнительный рисунок 3: Оптимальное декодирование с использованием 1-секундного ввода и сверток, не зависящих от времени.

( a ) Примеры переменных, декодированных из одного и того же набора данных с использованием однокадрового ввода ( слева ) и 51 кадра ( справа ), когда свертки не зависят от времени. Оранжевые треугольники отмечают моменты времени, когда мы можем легко увидеть различия в прогнозах между моделями. Серая линия обозначает истинные следы. Точки обозначают прогнозируемые трассы, окрашенные в зависимости от скорости бега.( b ) Производительность модели для всех наборов данных. Вверху: включение 11 кадров (временное окно 1 с) привело к наименьшей медианной ошибке декодирования положения (7,50 ± 0,60 см), что значительно отличается от ввода одного кадра (10,17 ± 0,43 см; статистика = 5, 90 135 p 90 136 < 1 90 135 e − 5). Внизу: включение 51 кадра (временное окно 5 с) привело к наименьшей медианной ошибке декодирования скорости (2,42 ± 0,09 см/с), что значительно отличается от ввода одного кадра (3,39 ± 0,14 см/с; статистика = 1, p < 1 e − 5).

Дополнительный рисунок 4: Производительность декодирования с преобразованием журнала на рабочих скоростях.

( a ) Схематическая диаграмма подготовки данных с логарифмическим преобразованием скоростей для создания логарифмически равномерного распределения. ( b ) Производительность модели для подмножества наборов данных в разных тестовых сгибах. Слева: исходная модель, обученная с линейными скоростями (11,49 ± 0,13 см, шалфей), имела значительно меньшую медианную ошибку в прогнозировании положения, чем та же модель, обученная с логарифмическими скоростями (12.45 ±0,14 см, кардинальное; Критерий знакового ранга Уилкоксона: статистика = 1 527 4374, 90 135 p 90 136 < 1 90 135 e 90 136 - 5). Справа: исходная модель, обученная линейным скоростям (3,76 ± 0,03 см/с, мудрец), имела значительно меньшую медианную ошибку в прогнозировании скоростей, чем та же модель, обученная логарифмическим скоростям (3,95 ± 0,04 см/с, кардинальное значение; критерий знакового ранга Вилкоксона). : статистика = 15506009, p < 1 e − 5).

Дополнительный рисунок 5: Производительность сети с отдельными потоками для поведения декодирования.

( a ) Схематическая диаграмма архитектур ConvNet с исходными стратегиями одновременного (вверху) и раздельного (внизу) декодирования. ( b ) Производительность модели для всех наборов данных. Вверху: Исходная модель с одновременным декодированием (10,17 ± 0,43 см, шалфей) имела значительно большую медианную ошибку в предсказании положения, чем модель с отдельными потоками декодирования (9,85 ± 0,42 см, кардинал; критерий знакового ранга Уилкоксона: статистика = 133, 90 135 р < 0,05). Внизу: оригинальная модель (3.39 ± 0,14 см/с, шалфей) имела значительно меньшую медианную ошибку в прогнозировании скоростей, чем модель с отдельными потоками декодирования (3,53 ± 0,16 см/с, кардинально; критерий знакового ранга Уилкоксона: статистика = 131, p <0,05) .

Дополнительный рисунок 6: Выбор модели с поиском гиперпараметров.

( a ) Схематическая диаграмма различных архитектур моделей. Мы передали обучение с помощью модели ResNet (вверху) и модели Mobilenet (в центре), предварительно обученных в Imagenet. Мы также разработали нейронную сеть с прямой связью, в которой максимальное объединение применялось к входным изображениям перед подачей сглаженных функций в плотные слои.Поиск по гиперпараметрам применялся ко всем моделям, и наилучшая комбинация выбиралась на основе результатов проверки. Подробности см. в разделе «Материалы и методы». ( b ) Сравнение моделей на проверочном наборе. Мы сравнили все модели с их лучшими наборами гиперпараметров и обнаружили, что модель ConvNet имеет наименьшие средние потери L1. ( c ) Поиск подмножеств гиперпараметров в проверочном наборе. Для модели ConvNet с 8 свёртками с 8 свёрточными слоями и 5 плотными слоями мы обнаружили, что обучающая модель со скоростью обучения 1e-4 без пакетной нормализации имеет наименьшую среднюю потерю L1.Эти гиперпараметры использовались для моделей во всех экспериментах.

Дополнительный рисунок 7: Примеры декодированных трасс в периоды STOP и обучающий набор.

( a ) Пример 10-секундных траекторий истинного (серый) и расшифрованного (черный) положений, когда животное в основном находилось в неподвижном состоянии. Расшифрованные следы образовывали последовательность, как если бы животное имитировало бег. ( b ) Декодированные переменные во времени во время периодов STOP в примере тестового набора. Серая линия обозначает истинные следы. Зеленые точки обозначают предсказанные трассы.( c ) Декодированные переменные во времени в примере обучающего набора. Точки обозначают прогнозируемые следы, окрашенные в фактические скорости бега.

Дополнительный рисунок 8: Кодирование поведенческой топологии во время периодов STOP в коллекторах по слоям модели.

( a ) Представления ансамбля из последнего сверточного слоя и плотного слоя обученной модели в типичном наборе данных в Т-образном лабиринте ( сверху ), H-лабиринте ( посередине ) и □-лабиринте ( внизу ) (те же модели, что и в рис. 7a ).( b ) Сравнение нейронных коллекторов, извлеченных из периодов БЕГА и СТОП (т. е. животные были либо неподвижны, либо бежали со скоростью ниже 5 см/с), в Т-образном лабиринте ( слева ), Н-лабиринте ( посередине) ) и □-лабиринт (справа). Во всех наборах данных множественное сходство было значительно выше, когда животные бегали (критерий знакового ранга Уилкоксона: статистика = 1, p <0,05).

Дополнительный рисунок 9: Согласованность поведенческих распределений между обучающими и тестовыми наборами.

( a ) Сходство средней занятости (плотность x-y) и средней скорости (AvgSpeed) между обучающей и тестовой выборками. Вверху: двухмерные корреляции карт занятости и скорости в разных лабиринтах. Внизу: все двухмерные корреляции (плотность x-y, средняя скорость) для тестовых складок. ( b ) Оценка разделения поезд/тест с использованием мер индекса структурного подобия (SSIM) для совместных распределений выходных меток. Вверху: SSIM для каждой парной переменной ( x, y ), ( x, v ) и ( y, v ) в различных экспериментах с лабиринтом.Внизу: SSIM (( x, y ), ( x, v ) и ( y, v )) на тестовых складках в различных экспериментах с лабиринтом.

Дополнительный рисунок 10: Возможные факторы, способствующие ошибкам декодирования.

( a ) Визуализация ошибок в пространстве из примера набора данных исследования Т-образного лабиринта. Тепловые карты представляют собой декодированные ошибки (а.е.) перед преобразованием обратно в исходные масштабы (см и см/с). Слева: пространственные карты мест возникновения ошибок декодирования. Справа: пространственные карты того, куда указывали ошибки (т.э., где были неверные прогнозы). ( b ) Слева: карты средней занятости (плотность x-y) тренировочного набора сверху и тестового набора снизу из примера набора данных a . Справа: карты средней скорости (AvgSpeed) тренировочного набора сверху и тестового набора снизу из примера набора данных a . Двумерные корреляции ( r ) между этими картами и картами ошибок были рассчитаны для оценки потенциальных факторов, влияющих на декодированные ошибки.Здесь, где указанная ошибка в основном коррелировала с картой AvgSpeed ​​обучающего набора ( r = 0,61, справа, вверху), а где произошла ошибка, в основном коррелировала с картой AvgSpeed ​​тестового набора ( r = 0,81 , справа, снизу ). ( c ) Во всех наборах данных, где указанная ошибка была больше коррелирована с картой AvgSpeed ​​обучающего набора ( r = 0,56 ± 0,02, зеленый; критерий знакового ранга Уилкоксона: статистика = 134, p <0,05 ) по отношению к другим факторам, но в целом корреляции были слабыми.С другой стороны, место, где произошла ошибка, в основном коррелировало с картой AvgSpeed ​​тестового набора ( r = 0,78 ± 0,01, синий; критерий знакового ранга Уилкоксона: статистика = 1, p < 1 e − 5 )

5 Материалы и методы

5.1 Сбор данных

Всего в экспериментах использовали 8 самцов мышей с фоном C57/B6. Все процедуры были одобрены Комитетом Массачусетского технологического института по уходу за животными и соответствовали рекомендациям, установленным Национальным институтом здравоохранения для ухода и использования лабораторных животных.

Опосредованная вирусом доставка генов

Сначала животных анестезировали 5% изофлураном в кислороде. На протяжении всей процедуры животных подвергали анестезии на стереотаксической хирургической раме (Kopf) с постоянным от 1,5% до 2% изофлюрана в кислороде. Трепанационное отверстие делается на расстоянии -1,5 мм медиально-латерально и 2,1 мм рострально-каудально от ориентира Брегмы. Используя моторизованный инжектор со скоростью 0,05 мк 90 136 л/мин, 0,5 90 135 мк 90 136 л pGP-AAV1-syn-jGCaMP7f-WPRE (титр: 1,9 x 1012 гк/мл) вводили в 1.5 мм под поверхностью черепа в трепанационном отверстии. После этого на кожу головы накладывали швы и вводили анальгетик (бупренекс, 0,05 мг/кг) до выздоровления животных.

Протокол имплантации

После инъекции вируса имплантацию линзы GRIN и имплантацию базовой пластины проводили отдельно. Во время имплантации животных анестезировали по тому же протоколу.

Линза GRIN

Поверхность черепа была обработана травильным гелем (C&B Metabond). Трепанация черепа 2 мм на 2.На черепе сделали трепанацию диаметром 2 мм, в центре – трепанационное отверстие от процедуры введения вируса. Корковая ткань была аспирирована, обнажая рострально-каудальную исчерченность прямо над СА1. Линза GRIN (диаметр 1,8 мм, шаг 0,25, 670 нм, Edmund) располагалась перпендикулярно поверх СА1 и фиксировалась к черепу клеем (Loctite 454). После этого обнаженный череп и область вокруг линзы GRIN были покрыты прозрачным стоматологическим цементом (C&B Metabond), а затем черной ортодонтической акриловой смолой, чтобы блокировать окружающий свет.Верх линзы GRIN был покрыт силиконовым клеем (Kwik-Sil).

Базовая пластина

С базовой пластиной, прикрепленной к микроэндоскопу (минископ UCLA), оптимальное поле зрения (FOV) было найдено с помощью визуализации и ручной регулировки угла крепления базовой пластины. После того, как было достигнуто оптимальное поле зрения, базисную пластину сначала зафиксировали на месте с помощью клея (Loctite 454), а затем прикрепили к черепу с помощью стоматологического цемента (M&B metabond).

Установка визуализации

Однофотонная визуализация кальция выполнялась с помощью минископа, устанавливаемого на голове.Мощность визуализации составляла примерно от 1 мВт до 10 мВт с поправкой на каждое животное. Светодиод возбуждения фильтруется полосовым фильтром 470/40. Испускаемые фотоны собирались датчиком CMOS, фильтровались полосовым фильтром 525/50 с частотой дискретизации 30 Гц. Поле зрения изображения составляло 480 на 752 пикселя, а оптимальная плоскость была достигнута во время имплантации базовой пластины.

5.2 Поведенческие задачи

После того, как животные полностью восстановились после предыдущих процедур (примерно через 3 дня после имплантации базовой пластины), на бодрствующих животных было проведено записей in vivo.

Акклиматизация минископа в домашней клетке

Животных прикрепляли к кабелям для визуализации, что позволяло им акклиматизироваться к минископу и привязываться в течение нескольких сеансов в домашней клетке, каждый сеанс длился 30 минут. Эта процедура повторялась в течение примерно 3 дней, пока животные не освоились с настройкой визуализации и не начали вести себя нормально.

Эксперименты по исследованию лабиринта

После сеансов акклиматизации с минископом животные подвергались экспериментам по исследованию лабиринта, в которых ограждения лабиринта были сделаны из гофрированных пластиковых листов (Home Depot).Формы этих лабиринтов можно разделить на Т-образные, Н-образные или □-образные. Каждый лабиринт имеет размер примерно 1 м на 1 м. Для каждого лабиринта животные проходили несколько сеансов, каждый сеанс длился около 30 минут. В нашем исследовании мы исключили первые несколько сеансов, когда конфигурация лабиринта была еще новой для животных, и использовали данные только в более поздних сеансах, когда животные уже были знакомы с окружающей средой.

5.3 Подготовка набора данных

Поведенческие данные

Для отслеживания поведения животных мы использовали веб-камеру с частотой дискретизации 60 Гц и синхронизировали изображение с помощью пакета (https://github.com/jonnew/Bonsai.Miniscope) для бонсай (Lopes et al., 2015). Красная лента на минископе, установленном на голове, отслеживалась как прокси для местоположения животного, сообщаемого как координаты положения ( x, y ).

Временная субдискретизация и сглаживание

Необработанные координаты x, y были субдискретизированы до 10 Гц и сглажены сглаживающим фильтром квадратичного порядка с конечной импульсной характеристикой Савицкого-Голея. Скорость v была дополнительно оценена по этим сглаженным координатам x, y.

Ортогонализация координат

Линейные зависимости между различными размерами выходных меток были минимизированы путем ортогонализации сглаженных координат x, y.Для Т-образного лабиринта координаты x, y были центрированы на пересечении двух перпендикулярных рукавов. Для H-лабиринта и □-лабиринта координаты x, y были центрированы в середине лабиринта. После центрирования жесткая матрица вращения (R) оценивалась посредством разложения по сингулярным числам (SVD) и применялась для ортогонализации координат x, y.

Масштабирование меток

Все поведенческие метки ( x, y, v ) были масштабированы в диапазоне [-1, 1].

Кальций-визуализация
Удаление артефактов движения

Для коррекции артефактов неравномерного движения, вызванных движением мозга, был применен NoRMCorre, метод быстрой нежесткой регистрации (Pnevmatikakis and Giovannucci, 2017).Этот алгоритм работает путем разделения FOV на перекрывающиеся пространственные участки, которые затем регистрируются с субпиксельным разрешением для жесткого перемещения по шаблону. После этого было создано сглаженное поле движения для каждого кадра путем повышающей дискретизации предполагаемых совмещений.

Пространственное понижение дискретизации и кадрирование

Изображения были уменьшены по каждому измерению в 2 раза, что привело к размеру 240 на 376 пикселей. Поле зрения было обрезано до 224 на 224 пикселя путем удаления окружающих областей, не содержащих сигналов кальция.

Исходное разложение и шумоподавление

Этот шаг применялся только для генерации данных для базового декодера (т. е. он был пропущен для нашего сквозного декодера). Для отделения различных источников, таких как одиночные нейроны и нефокусная флуоресценция от нейропиля, был применен алгоритм CNMFe (Zhou et al., 2018). Гиперпараметры, такие как предполагаемый диаметр нейрона, были оптимизированы для набора данных каждого животного. Средние кривые флуоресценции C из областей интереса (ROI) были извлечены и очищены от шума посредством деконволюции пиков.ROI со слабой (пик C ниже 100% dF/F) или спорадической активностью (менее 3 кальциевых переходных процессов) были исключены. Предполагалось, что остальные ROI являются предполагаемыми нейронами. Временные действия C использовались в качестве входных данных для базового декодера.

Временная субдискретизация

Изображения кальция были субдискретизированы до 10 Гц.

Масштабирование пикселей

Амплитуды необработанных пикселей изображения (0-255) были масштабированы в диапазоне [-1, 1].

Эксперимент с остаточной информацией
Raw

Этот набор состоял из исходных изображений ( Y ) после удаления артефактов движения, обрезки FOV и масштабирования пикселей.

Чистый

Матрица видео была получена после алгоритма CNMFe путем умножения матрицы пространственного следа A на матрицу временной динамики C . Кадры изображений из этой видеоматрицы содержали только предполагаемые нейроны и поэтому были названы чистыми изображениями.

Остаточные

Остаточные изображения были получены путем вычитания чистых изображений из необработанных изображений, т. е. Y AC . Теоретически релевантная для поведения информация на этих изображениях поступала из фоновых остатков, поскольку любые временные колебания предполагаемых нейронов, вызванные спайками, были извлечены в матрицу временной динамики C .В идеале в остаточных изображениях отсутствует информация от предполагаемых нейронов. Однако алгоритм CNMFe обновляет параметры с помощью чередующихся итераций, так что временные колебания, вызванные всплеском, могут быть не полностью зафиксированы в чистых изображениях. Чтобы еще больше исключить информацию, вызванную спайками, оставшуюся на остаточных изображениях, местоположения предполагаемых нейронов были скрыты с помощью методов Hollow ROI или Hollow A.

Полая область интереса

Изображения полой области интереса были получены после окклюзии предполагаемых клеток после установки локального адаптивного порога.Порог вычислялся для каждого пикселя в соответствии с характеристиками изображения в движущемся круглом окне. Локальный порог вычислялся по методу Ниблэка: где k = 0,2, c = 0, μ — среднее значение пикселя в пределах окна, а σ — стандартное отклонение значений пикселя в пределах окна.

Hollow A

Изображения Hollow A были получены после закрытия всей матрицы пространственного следа A из остаточных изображений. Это дополнительно удалило любые локальные сигналы, связанные с каждой ячейкой.

Скремблирование изображений

Каждый пиксель в каждом изображении был случайным образом переставлен в каждой строке. Распределения пикселей остались идентичными, но пространственные закономерности были разрушены.

Случайные изображения

Кадры изображения были синтезированы путем выборки каждого пикселя из равномерного распределения, которое имело тот же минимум и максимум, что и исходные кадры изображения. Синтезированные изображения представляли собой случайный шум. В качестве уровня вероятности использовались декодеры, обученные на случайных изображениях.

5.4 Моделирование декодера

Оценка набора данных
Разделение набора данных Train/Val/Test

Набор данных был разделен на периоды «RUN» и «STOP» на основе скорости бега с порогом разделения 5 см/с.Для большей части обучения и оценки нашей модели период «СТОП» был исключен из анализа, если не указано иное. Набор данных каждого животного был сегментирован на 5 последовательных блоков. Следуя правилу разделения 80-20, один из этих блоков был выбран в качестве тестового набора, а остальные использовались в качестве обучающего набора. На этапе разработки модели обучающий набор был разделен на 5 последовательных блоков, один из которых был выбран случайным образом в качестве проверочного набора.

Показатели сходства для совместного распределения

Для количественной оценки сходства между совместным распределением парных переменных (( x, y ), ( x, v ), ( y, v )) между обучающей выборкой и тестом набор, мера индекса структурного сходства (SSIM) (Wang et al., 2004) был выполнен с библиотекой scikit-image . Совместное распределение обучающей выборки рассматривалось как изображение (Im train ), как и совместное распределение тестовой выборки (Im test ). Каждое изображение свертывалось с нормализованным ядром Гаусса шириной 90 135 σ 90 136 = 1,5, что приводило к множеству патчей. SSIM рассчитывался на основе различных патчей из двух изображений. где c 1 и c 2 — константы, μ и σ — статистические признаки всех этих пятен.Если SSIM = 1, два изображения совместных распределений имеют одинаковые текстуры. Более низкий SSIM предполагает больше различий между двумя наборами.

Показатели сходства для карты средней занятости и карты средней скорости

Карта занятости, т. е. карта плотности x-y, представляет собой двухмерный шестиугольный график биннинга, количественно определяющий нормализованную занятость в лабиринте. Карта средней скорости, то есть карта AvgSpeed, представляет собой двумерный шестиугольный график биннинга, определяющий среднюю скорость в лабиринте. 25 бинов использовались в направлениях x и y. Для количественной оценки сходства карты занятости и карты средней скорости между тренировочным набором и тестовым набором использовался коэффициент двумерной корреляции ( r ).Если r = 1, это предполагает, что обучающая и тестовая выборки имеют одинаковые карты. Меньшее значение r указывает на большую разницу между двумя комплектами.

Базовый декодер

В качестве базового декодера мы использовали нейронную сеть с прямой связью с регрессионной головкой и идентифицировали ROI как предполагаемые нейроны на микроэндоскопических изображениях и построили декодер на основе временной активности этих ROI. Средние следы флуоресценции от N идентифицированных ROI формировали N-мерный вход, а декодер выдавал положение животного и скорость бега.Учитывая, что производительность декодирования зависит от входных представлений, мы подготовили различные представления следующим образом.

Сглаженные следы ROI после удаления фона (FFNN(ROI))

Сначала мы получили проекцию средней интенсивности из стеков изображений, а затем размыли проекционное изображение с помощью движущегося 2D-фильтра Гаусса с размером около 25% FOV , используя ImageJ (Schindelin et al., 2012). Размытая проекция считалась глобальным фоном и вычиталась из всех необработанных изображений.Впоследствии была применена операция анизотропной диффузии (Perona and Malik, 1990) для дальнейшего устранения шума на изображениях, за которой последовала операция морфологического раскрытия с использованием кругового структурного элемента, размер которого подобен размеру нейрона в поле зрения. После этого мы получили проекцию максимальной интенсивности из изображений с шумоподавлением, фон которых был удален, и аннотировали области интереса с помощью инструмента ImageJ Cell Magic Wand. Средняя кривая флуоресценции для каждой области интереса сглаживается сглаживающим фильтром Савицки-Голея.

Глобально нормализованные трассы с шумоподавлением из CNMFe (FFNN(normG))

Другое входное представление было создано с помощью временных трасс с шумоподавлением с помощью алгоритма CNMFe (Zhou et al., 2018). Средняя трасса флуоресценции C для каждой ROI была нормализована глобальным максимумом по всем трассам. При этой процедуре корреляции между нейронами были информативными и, таким образом, относительные величины между ними сохранялись.

Сквозной декодер с входными изображениями
Задача регрессии

Сквозной декодер принимал каждый кадр изображения в качестве входных данных и предсказывал поведенческие атрибуты животного (положение и/или скорость) в соответствующий момент времени.Проблема декодирования может быть сформулирована как задача классификации нескольких классов путем группирования поведенческих переменных, но мы решили сформулировать проблему как задачу регрессии по следующим причинам. Во-первых, животные свободно исследовали лабиринт, поэтому заселенность лабиринта и распределение скорости бега были сильно несбалансированными. Тем не менее, размер данных был недостаточно большим для недостаточной выборки данных для создания однородного распределения, но при избыточной выборке классов меньшинств с использованием таких методов, как SMOTE (Chawla et al., 2002) внесли дополнительную погрешность. Кроме того, общая функция потерь в задаче классификации не могла сохранить порядковую связь между позициями и скоростями, т. е. ошибка предсказания между соседними позициями и ошибка между удаленными позициями были одинаковыми при использовании перекрестной энтропии.

Размеры вывода (или количество атрибутов) зависели от стратегии декодирования (одновременное или раздельное).

Одновременное декодирование

Для стратегии одновременного декодирования уровни свертки и прямой связи были общими для извлечения признаков для кодирования положения и скорости, а разные веса использовались только в последнем слое для предсказания положения и скорости.В этом случае в заголовке регрессии есть 3 выходные метки ( x, y, v ).

Отдельное декодирование

Для отдельной стратегии декодирования было два набора сверток и слоев прямой связи, отдельно обученных для прогнозирования положения и скорости. В этом случае один декодер имеет 1 выходную метку ( v ), а другой — 2 выходные метки ( x, y ).

Сверточная нейронная сеть Vanilla (ConvNet)

В качестве входных данных модель использовала изображение в градациях серого (одноканальное) и использовала сверточные слои, подключенные к головке регрессии, для декодирования непрерывного поведения.Размер ядра 3 использовался для всех двумерных сверток. Количество фильтров было удвоено для каждого последующего слоя и достигло 512. Для понижения частоты дискретизации мы использовали шаг 2, чтобы заменить объединенные слои для повышения вычислительной эффективности. После свертки элементы были сглажены и помещены в серию плотных слоев. Количество единиц уменьшалось вдвое для каждого последующего плотного слоя. Чтобы поощрить разреженность сети и ускорить обучение без риска введения умирающих единиц, Leaky-Relu использовалась в качестве функции активации, за исключением последнего слоя.Последний слой был применен с функцией активации Tanh, чтобы выходные значения соответствовали диапазону целевых меток.

Количество сверточных слоев, количество полносвязных слоев и количество единиц в первом полносвязном слое являются гиперпараметрами. Оцененная на проверочном наборе, выбранная модель, используемая в этом исследовании, имела 8 сверточных слоев и 5 полносвязных слоев (с количеством единиц = [256, 64, 32, 16, 3] соответственно). В нашей задаче добавление пакетной нормализации ухудшило производительность предсказания, поэтому мы не использовали пакетную нормализацию в нашем декодере.

Остаточная нейронная сеть с 50 слоями (ResNet-50)

Модель ResNet (He et al., 2016) изначально была разработана для получения входного изображения RGB для задач распознавания объектов, поэтому изображения в градациях серого были преобразованы в изображения RGB, с вычитанием среднего значения на пиксель. Мы сохранили архитектуру извлечения признаков, состоящую из сверточных блоков и блоков идентификации, и заменили архитектуру классификации плотными слоями, функциями активации которых были Leaky-Relu (первые несколько слоев) и Tanh (последний слой).

Для переносного обучения параметры в архитектуре извлечения признаков были предварительно обучены ImageNet и заморожены во время обучения модели, тогда как параметры в плотных слоях обновляются во время обучения. После этого последние несколько слоев архитектуры извлечения признаков были разморожены и обучены совместно с новыми плотными слоями. Для обучения с нуля все параметры в модели были инициализированы с помощью инициализации Xavier (Glorot and Bengio, 2010).

Эффективная сверточная сеть для мобильных приложений (MobileNet)

MobileNet (Howard et al., 2017) был разработан для достижения облегченной архитектуры путем замены сверточного слоя глубинным сверточным слоем, за которым следует точечный сверточный слой, который объединяет эти отфильтрованные значения для создания новых функций. Он использовал шаг 2 для уменьшения пространственных размеров вместо объединения слоев. К этому декодеру применялись те же шаги предварительной обработки, что и в модели ResNet. Точно так же в этом исследовании были выполнены процедуры как трансферного обучения, так и обучения с нуля.

Нейронная сеть с прямой связью (FFNN)

Мы создали нейронную сеть с прямой связью для изучения функций непосредственно через плотные соединения. Модель сначала применила максимальное 2D-объединение к каждому изображению в градациях серого для пространственной субдискретизации, а затем сгладила эти функции для серии плотных слоев. Количество блоков, функции активации и процедура поиска гиперпараметров были такими же, как и в ванильной ConvNet.

Сквозной декодер с видеовходами

Мы также создали сквозной декодер, который брал короткое видео с размером окна N для прогнозирования поведения центроидов в соответствующие моменты времени.Были разработаны две архитектуры в зависимости от того, распределялись ли сверточные веса во времени.

Свертки, не зависящие от времени

Входное измерение расширилось от одного канала до нескольких каналов, каждый из которых соответствует кадру изображения. Архитектура декодера сохранила оригинальную сверточную нейронную сеть с двумерными ядрами. Характеристики из разных кадров были взвешены и объединены после первого слоя. Не было никаких ограничений на сверточные ядра.

Свертки, общие во времени

Входное измерение расширено временным измерением для N кадров. Каждый кадр проходил через блок сверточных слоев, веса которых были разделены во времени, создавая характерную для кадра функцию. Эти специфичные для кадра функции были линейно взвешены слоем внимания, а затем интегрированы в окончательный элемент F post перед вводом в плотные слои модели.

Процедура обучения

Для обучения модели использовался мини-пакетный градиентный спуск.Для каждой мини-партии из обучающего набора случайным образом выбиралось подмножество входных изображений и выходных меток. Каждое входное изображение имело соответствующие нормализованные выходные метки ( x, y, v ). Размер партии (т. е. количество выборок на шаг) составлял 64, а порядок выборок менялся для каждой эпохи. Поиск гиперпараметров был достигнут путем поиска по сетке для скорости обучения, количества сверточных слоев, количества плотных слоев, количества единиц и отсева. Оптимизация Адама использовалась для ускорения обучения.Веса и смещения ядра инициализируются при инициализации Xavier (Glorot and Bengio, 2010) и обновляются путем обратного распространения потерь L1, т. е. абсолютных разностей между оценочными и целевыми значениями. где y i — истинное значение, — предсказанное значение для выборки i, m — размер пакета, а d — размерность выходных данных модели ( d =3 для одновременного декодирования и d =1 для раздельного декодирования).

Обучение было остановлено, когда количество шагов итерации достигло 50 000 или когда производительность проверки осталась неизменной или увеличилась за 5 эпох.Переменные модели и гиперпараметры обучения сохранялись в контрольной точке каждые 500 шагов итерации. Обучение проводилось на GeForce RTX 2080 Ti с использованием Tensorflow, а для поиска по сетке использовались параллельные вычисления.

Показатели оценки

После обучения модели ее производительность оценивалась на тестовом наборе. Учитывая, что выходные данные модели нормализованы, прогнозируемые значения были преобразованы обратно в исходные масштабы в [см] и [см/с]. После этого мы рассчитали евклидово расстояние между каждой наземной истиной и ее предсказанным положением и использовали медиану среди этих ошибок в качестве показателя производительности для декодирования положения.Для скоростного декодирования мы рассчитали абсолютную разницу между каждой наземной истиной и ее предсказанным значением и использовали медианную ошибку в качестве показателя производительности. Для эксперимента или конкретной модели, оцениваемой на нескольких наборах данных, распределение средней ошибки декодирования описывалось как среднее ± стандартная ошибка.

Расчет уровня вероятности

Уровень вероятности определялся как производительность декодирования с использованием случайных изображений (см. предыдущий раздел Эксперимент с остаточной информацией).

5.5 Многообразный анализ

Чтобы визуализировать представление ансамбля на каждом сетевом уровне в нашем декодере, ансамбли в разные моменты времени были спроецированы в низкоразмерное подпространство.

Isomap

Isomap — это нелинейный алгоритм уменьшения размерности для поиска вложений, который поддерживает геодезические расстояния между всеми точками данных. Мы использовали scikit-learn (Pedregosa et al., 2011) для реализации этого алгоритма и извлекли низкоразмерные вложения каждого слоя. Оптимальное количество ближайших соседей ( K opt ) было выбрано путем нахождения колена, при котором кривая ошибки реконструкции (ER) переставала значительно уменьшаться с большим количеством ближайших соседей.где N — количество выборок, D x и D y соответствуют тем же определениям, что и выше, а K — ядро ​​Isomap.

Метрики подобия многообразия

Для измерения геометрического сходства между многообразием и поведенческой топологией, сформированной положением, мы рассчитали корреляцию Пирсона между попарными расстояниями в двумерных координатах многообразия и поведенческих координатах (Low et al., 2018), которая использовалась в качестве метрики для оценки обучения на разных сетевых уровнях.

5.6 Карта заметности сети

Чтобы лучше интерпретировать, как сеть кодировщика делает прогнозы, мы использовали карту значимости, чтобы указать пиксели, изменения которых оказывают наибольшее влияние на прогноз. Вместо того, чтобы напрямую распространять выходной градиент на вход (Simonyan et al., 2013), мы модифицировали метод карты активации классов с взвешенным градиентом (Grad-CAM) (Selvaraju et al., 2017), чтобы создать более гладкую карту заметности.

Grad-CAM изначально разработан для обратного распространения градиентов оценки целевого класса y c на последний сверточный слой, карты признаков которого сохраняют пространственную информацию, и создания локализованной карты значимости L c для класса c, с помощью взвешенной комбинации карт активации A k с последующей операцией ReLU, как в уравнении (4).

Мы модифицировали Grad-CAM, поскольку в нашем исследовании использовалась задача непрерывной регрессии. Мы визуализировали значимость входных данных, которые либо увеличивали, либо уменьшали выходные данные, вычисляя абсолютные градиенты. Мы также адаптировали этот алгоритм для визуализации карт заметности различных фильтров в сетевой модели путем вычисления градиентов от фильтра на определенном слое по отношению к ближайшему сверточному слою, чьи карты признаков имели достаточно большое пространственное разрешение.

5.7 Статистический анализ

Статистический анализ проводили с использованием SciPy (Virtanen et al., 2020). Все значения были представлены как среднее ± стандартное отклонение. если не указано другое. Критерии знакового ранга Уилкоксона использовались, когда парные выборки не были распределены нормально. Для случаев, соответствующих требованию нормальности, использовался критерий Стьюдента. Поправка Бонферрони использовалась для множественных сравнений. Для получения корреляций использовалась корреляция Пирсона.

Список литературы

  1. x .Глорот и Ю. Бенжио. Понимание сложности обучения нейронных сетей с глубокой прямой связью. В разбирательстве тринадцатой международной конференции по искусственному интеллекту и статистике, страницам 249-256, 2010. 39, 40

  2. K. Он, X Чжан, С. Рен и Дж. Сун. Глубокое остаточное обучение для распознавания изображений. В материалах конференции IEEE по компьютерному зрению и распознаванию образов, стр. 770–778, 2016 г.39

  3. R.Р. Сельвараджу, М. Когсуэлл, А. Дас, Р. Ведантам, Д. Парих и Д. Батра. Grad-cam: Визуальные объяснения из глубоких сетей с помощью локализации на основе градиента. В разбирательстве IEEE Международная конференция на компьютерное зрение, страницы 618-626, 2017. 10, 16, 41

  4. м .Д. Цайлер и Р. Фергус. Визуализация и понимание сверточных сетей. На Европейской конференции по компьютерному зрению, стр. 818–833. Springer, 2014. 16

%PDF-1.4 % 53 0 объект > эндообъект внешняя ссылка 53 73 0000000016 00000 н 0000001808 00000 н 0000002646 00000 н 0000002946 00000 н 0000003185 00000 н 0000004071 00000 н 0000004477 00000 н 0000004969 00000 н 0000005745 00000 н 0000006119 00000 н 0000010399 00000 н 0000015858 00000 н 0000016271 00000 н 0000016584 00000 н 0000016959 00000 н 0000017139 00000 н 0000017195 00000 н 0000017216 00000 н 0000017965 00000 н 0000018356 00000 н 0000018596 00000 н 0000018675 00000 н 0000018978 00000 н 0000019167 00000 н 0000021714 00000 н 0000022212 00000 н 0000022449 00000 н 0000022844 00000 н 0000023197 00000 н 0000023218 00000 н 0000024214 00000 н 0000024597 00000 н 0000025189 00000 н 0000025968 00000 н 0000026491 00000 н 0000033013 00000 н 0000033034 00000 н 0000034026 00000 н 0000034047 00000 н 0000034977 00000 н 0000034998 00000 н 0000035914 00000 н 0000036283 00000 н 0000036648 00000 н 0000037217 00000 н 0000042979 00000 н 0000043459 00000 н 0000043480 00000 н 0000044451 00000 н 0000044757 00000 н 0000049401 00000 н 0000049761 00000 н 0000050234 00000 н 0000050655 00000 н 0000051350 00000 н 0000051736 00000 н 0000052067 00000 н 0000052480 00000 н 0000052886 00000 н 0000053195 00000 н 0000056408 00000 н 0000056595 00000 н 0000059957 00000 н 0000060486 00000 н 0000060508 00000 н 0000061445 00000 н 0000061467 00000 н 0000062330 00000 н 0000063013 00000 н 0000063129 00000 н 0000064071 00000 н 0000001881 00000 н 0000002624 00000 н трейлер ] >> startxref 0 %%EOF 54 0 объект > эндообъект 124 0 объект > поток Hb«`f«d`g`e`@

Точность декодирования в рибосомных A- и P-сайтах: влияние мутаций в трех различных областях декодирующего домена в 16S рРНК | Исследование нуклеиновых кислот

Аннотация

Участие определенных областей 16S рРНК Escherichia coli в точности декодирования было исследовано путем анализа влияния мутаций рРНК на ошибки неправильного считывания в рибосомных сайтах A и P.Мутации в области 1400–1500, петле 530 и в области 1050/1200 (спираль 34) вызывали считывание стоп-кодонов и сдвиг рамки считывания во время элонгации и стимулировали инициацию кодонов, отличных от AUG, при инициации синтеза белка. Эти результаты указывают на участие всех трех областей 16S рРНК в функциях декодирования как в А-, так и в Р-сайтах. Функциональное сходство всех трех классов мутантов согласуется с близкой физической близостью области 14001500, петли 530 и спирали 34 и предполагает, что все три области рРНК содержат декодирующий домен в рибосоме.

Введение

Для точного декодирования мРНК необходимо активное участие рибосомных компонентов. Вовлечение рибосомных белков в этот процесс было продемонстрировано классическими генетическими анализами, которые выявили участие нескольких рибосомных белков в точности декодирования (1). Хотя в этих исследованиях не было выделено мутаций рибосомной РНК, данные из многих различных источников идентифицировали рРНК как незаменимый компонент на всех этапах трансляции. Сайты взаимодействия тРНК, мРНК и других лигандов с рРНК были идентифицированы с помощью перекрестного связывания, химического следа и сайт-направленного мутагенеза (обзор в 2).Среди первых полученных перекрестных связей тРНК-рибосомы была перекрестная связь нулевой длины между основанием 34 антикодона тРНК, связанной с сайтом P, и C1400 16S рРНК (3). Многие из последующих биохимических и генетических исследований подтвердили важность области 1400–1500 малой субъединицы рРНК в связывании тРНК и антибиотиков, декодировании и межсубъединичном взаимодействии. Кроме того, Purohit и Stern (4) показали, что короткий олигорибонуклеотид, который имитирует область 1400–1500 малой субъединицы рРНК, может взаимодействовать с аминогликозидными антибиотиками и тРНК способом, удивительно сходным с взаимодействием интактной молекулы 16S рРНК с этими тРНК. лиганды.

В свете большого количества данных, связывающих область 1400–1500 16S рРНК с декодированием, эту область назвали центром декодирования или сайтом декодирования. Однако другие области молекулы 16S рРНК также участвуют во взаимодействиях рибосома-тРНК-мРНК (5). Кроме того, сайт-направленное сшивание мРНК-рРНК показало, что, помимо области 1400–1500, петля 530 и области 1050/1200 спирали 34 (рис. 1) также близки к участку кодон-антикодон. взаимодействие (6). Чтобы подчеркнуть вклад нуклеотидов рРНК за пределами области 1400–1500 в декодирование, термин «декодирующий домен» использовался для обозначения всех областей 16S рРНК, которые затрагивают декодирование (7).

Функциональная роль определенных сайтов в рРНК была проанализирована путем изучения эффектов мутаций в этих сайтах на определенные функции рибосом (8,9). В настоящем исследовании мы проанализировали влияние мутаций в трех различных областях декодирующего домена на отбор тРНК во время фаз инициации и элонгации трансляции. Как и ранее охарактеризованные мутации с заменой оснований в петле 530 и спирали 34 (10,11), мы обнаружили, что различные мутации в области 1400–1500 16S рРНК способствуют прочтению стоп-кодона и сдвигу рамки во время элонгации.Это указывает на то, что эти мутации влияют на отбор тРНК в А-сайте рибосомы. Однако мутации в тех же трех областях 16S рРНК, а также отсутствие посттранскрипционной модификации оснований A1518 и A1519 увеличивают частоту инициации с кодонов, отличных от AUG, указывая на то, что у этих мутантов также нарушено декодирование P-сайта. . В совокупности наши данные показывают, что на отбор тРНК как в А-, так и в Р-сайтах влияют одни и те же три области 16S рРНК, и это согласуется с представлением о том, что эти три области находятся в непосредственной близости от места взаимодействия кодон-антикодон в рибосоме. .

Материалы и методы

Бактериальные штаммы

Штамм

M41 и его производное recA⁻ MC140 использовали в качестве стандартных штаммов дикого типа (12). Устойчивые к касугамицину ( ksgA ) мутанты были получены от покойного доктора Питера ван Книппенберга (Лейденский университет). Мутация ksgA19 была перенесена в генетический фон MC41 путем трансдукции штамма MC86 (MC41 thr34::Tn10) в независимость от треонина с помощью фага P1, полученного на штамме, содержащем ksgA19, и скрининга на устойчивость к касугамицину.Полученный штамм был обозначен MC178.

Рисунок 1

Вторичная структура E.coli 16S рРНК (57), показывающая сайты мутаций и посттранскрипционных модификаций, проанализированных в этом исследовании. Указаны идентичности оснований дикого типа.

Рисунок 1

Вторичная структура E.coli 16S рРНК (57), показывающая сайты мутаций и посттранскрипционных модификаций, проанализированных в этом исследовании. Указаны идентичности оснований дикого типа.

Таблица 1

Плазмиды LacZ, использованные в этом исследовании

Таблица 1

Плазмиды LacZ, использованные в этом исследовании

рРНК и

плазмиды lacZ В этом исследовании

Мутантная рРНК экспрессировалась из двух разных наборов плазмид. В pKK3535 интактный оперон rrnB конститутивно транскрибируется с нативных промоторов P 1 P 2 (13). В pNO2680 (14) рРНК транскрибируется с промотора λ P l .В присутствии чувствительного к температуре репрессора l cI (поставляемого на устойчивой к неомицину, полученной из pSC101 плазмиде pLG857; 12) транскрипция кодируемой плазмидой рРНК подавляется при 30°C, но может индуцироваться при сдвиге культуры до 42°C. C. Ряд однонуклеотидных замен в 16S рРНК, включая C1395U, △C1400, C1407U, G1505U, C1192U и G529U, были перенесены на плазмиды, полученные из pNO2680 (15,16). Мутации в положениях A792 и G1530/A1531 были перенесены в плазмиды, полученные из pKK3535, которые, кроме того, содержали мутацию C1192U устойчивости к спектиномицину (17,18).

Серия плазмид pSG, содержащих сдвиг рамки считывания и нонсенс-мутации на 5′-конце гена lacZ , была описана ранее, и соответствующие последовательности приведены в таблице 1 (11,12). Плазмида pSG25 происходит от pACYC184 и совместима как с производной от pSC101 плазмидой pLG857, кодирующей репрессор l, так и с происходящими от pBR322 rrnB -содержащими плазмидами pNO2680 и pKK3535. Инициирующий кодон AUG в плазмиде pSG25 lacZ дикого типа ограничен с 5′- и 3′-сторон сайтами Eco RI и Hin dIII соответственно.Плазмиды, содержащие кодоны, отличные от AUG, конструировали путем замены фрагмента Eco RI -Hin dIII длиной 20 п.н. парами комплементарных синтетических олигонуклеотидов, содержащих кодоны инициации AUN или NUG. Первичная структура всех мутантных плазмид была подтверждена секвенированием нуклеотидов, соответствующие последовательности перечислены в таблице 1.

Культуральная среда и условия роста

Бактерии обычно культивировали в среде Луриа-Бертани (LB).При необходимости добавляли антибиотики в следующих концентрациях: тетрациклин 12,5 мкг/мл; неомицин, 50 мкг/мл; ампициллин 250 мкг/мл; касугамицин, 100 мкг/мл. Активность β-галактозидазы в клетках, несущих как мутантную рРНК, так и плазмиды pSG, измеряли после разбавления ночных культур и роста при 42°C (для плазмид, полученных из pNO2680) или 37°C (для pKK3535 и ее производных) в течение 150 мин, и анализировали. как описано ранее (12).

Выделение и секвенирование β-галактозидазы

Для выделения β-галактозидазы из штаммов, содержащих конструкцию lacZ и плазмиду рРНК, полученную из pNO2680, в 2 мкл среды LB инокулировали 200 мл клеток, выращенных в течение ночи при 30°C.Экспрессию мутантной рРНК индуцировали выращиванием этих культур при 42°С в течение 3–5 ч. Собирали клетки и выделяли, очищали и секвенировали β-галактозидазу, как описано ранее (19).

Результаты

Мутации в центре декодирования 16S рРНК снижают точность декодирования сайта А

Ранее мы описали конструкцию мутаций в положениях C1395, C1400, C1407 и G1505. Делеция C1400 и мутации C→U в положениях 1395 и 1407 имели доминантный летальный фенотип, а мутантные рРНК могли экспрессироваться только временно с индуцируемого промотора (15).Мутации в G1505 мало влияли на жизнеспособность клеток и в сочетании с мутациями C1395U, △C1400 или C1407U подавляли летальность мутаций с одним основанием. В рамках нашего анализа влияния определенных областей 16S рРНК на функции декодирования мы исследовали влияние этих мутаций на считывание стоп-кодона и сдвиг рамки считывания. Штаммы, несущие плазмиды, кодирующие чувствительный к температуре аллель репрессора λcl, и конструкций lacZ , содержащих стоп-кодоны или сдвиги рамки считывания в 5′-части кодирующей области, трансформировали плазмидой рРНК дикого типа (pNO2680), и каждый из мутантных Плазмиды рРНК и транскрипцию мутантной рРНК индуцировали путем переноса культур на 42°C.Данные в таблице 2 показывают, что мутации в С1400, С1395, С1407 и G1505 вызывали от 2 до 5-кратного увеличения уровня считывания стоп-кодонов и сдвига рамки считывания. Считывание стоп-кодонов происходит путем связывания почти родственной тРНК с триплетом терминации в А-сайте, в то время как сдвиг рамки считывания может быть связан с событиями декодирования как А-, так и Р-сайтов (20). Эти данные показывают, что одним из эффектов мутаций в центре декодирования является нарушение кодон-антикодоновых взаимодействий в А-сайте и снижение точности удлиняющихся рибосом.

Таблица 2

Влияние мутаций рРНК на считывание стоп-кодона и сдвиг рамки считывания

Таблица 2

Влияние мутаций рРНК на считывание стоп-кодона и сдвиг рамки считывания

Характеристика событий рибосомного смещения рамки считывания с помощью секвенирования белка

Механизм сдвига рамки считывания, вызванный мутациями рРНК, описанный в предыдущем разделе и в нашей предыдущей работе (11,16), был дополнительно проанализирован с помощью N-концевого секвенирования β-галактозидазы, выделенной из штаммов, несущих выбранные мутации рРНК, и конструкций со сдвигом рамки lacZ . .Секвенирование белка β-галактозидазы, выделенной из штамма, экспрессирующего мутацию рРНК C1407U и сдвиг рамки считывания pSG12DP-1 lacZ , дало следующую последовательность: M I T (L+R) S L G I R I P (рис. 2). Это предполагает, что в месте сдвига рамки считывания (UUG GGA UAA) декодирующая GGA тРНК Gly скользит назад на одно основание на 5′-перекрывающийся кодон GGG глицина. Этот сайт сдвига рамки считывания, где ряд повторяющихся нуклеотидов граничит с 3′-стороны внутрирамочным стоп-кодоном, представляет собой «сдвиговую остановку» и широко изучался Weiss et al. (21). Их анализ выявил важность перекрывающегося родственного кодона в новой рамке считывания и соседнего стоп-кодона в исходной рамке считывания. Усиливающий эффект стоп-кодона предполагает, что проскальзывание тРНК происходит, когда тРНК Gly находится в P-сайте, а стоп-кодон расположен в A-сайте. Секвенирование белка показало, что в положении 4 были обнаружены аргинин, а также ожидаемый лейцин (рис. 2). Происхождение аргинина в этом положении неизвестно, но оно может происходить из-за (неправильного) считывания лейцинового кодона CUG с помощью CGG-декодирующей тРНК Arg из-за несоответствия кодон-антикодон во втором положении.

Сдвиг рамки считывания в направлении +1 также характеризовался секвенированием белков. Наши предыдущие анализы показали, что мутация G529U дает 6-кратное увеличение сдвига рамки +1 в конструкции pSGlac7 (16). Секвенирование β-галактозидазы, выделенной из штамма, экспрессирующего мутацию рРНК G529U и сдвиг рамки считывания pSGlac7, дало последовательность M R V S G P N (фиг. 3; данные по последовательности белка не показаны). Эта неожиданная последовательность предполагает, что вместо того, чтобы инициироваться в AUG, трансляция началась с нижестоящего кодона GUG, за которым последовало связывание AGG-декодирующей тРНК Arg на одно основание вне рамки и продолжение трансляции в +1 рамке считывания (рис. .3). Стоп-кодон UAG, который следует за предполагаемым инициирующим кодоном GUG, может индуцировать паузу трансляции, которая способствует связыванию тРНК вне рамки считывания с сайтом A. Предлагаемый механизм сдвига рамки имеет некоторое сходство с запрограммированным рибосомным сдвигом рамки считывания в элементе Ty3 дрожжей (22). На стыке рамок считывания GAG3 и POL3 в Ty3 последовательность из семи оснований GCG A GUU декодируется как аланин-валин. Было показано, что низкая доступность AGU-декодирующей тРНК Ser способствует событию сдвига рамки Ty3.Как при сдвиге рамки считывания Ty3, так и при предполагаемом сдвиге рамки считывания в конструкции pSGlac7 проскальзывание тРНК не требуется. Хотя инициация трансляции на мРНК pSGlac7, по-видимому, происходила в кодоне GUG, в этой конструкции lacZ отсутствует узнаваемая последовательность Шайна-Дальгарно на подходящем расстоянии вверх по ходу транскрипции. Следовательно, инициация в GUG может потребовать, чтобы рибосомы инициировались в кодоне bona fide AUG, заканчивались в кодоне UAG в рамке и повторно инициировались в предшествующем кодоне GUG путем обратного сканирования (23,24).Различные элементы этой модели изображены на рисунке 3. Оба типа охарактеризованных здесь событий сдвига рамки считывания стимулируются мутациями в области G517, G529, C1400 и спирали 34 (таблица 2; 10, 11, 16). Это предполагает, что мутации в каждой из этих трех областей 16S рРНК вызывают проскальзывание тРНК, нарушая контакты тРНК-мРНК в P-сайте, и способствуют связыванию тРНК вне рамки считывания, ослабляя жесткость отбора тРНК в A-сайте.

Рисунок 2

N-концевое секвенирование β-галактозидазы, очищенной от штамма, несущего мутацию рРНК C1407U, и конструкцию со сдвигом рамки считывания pSG12DP-1 lacZ .Показан выход в пмоль выбранных аминокислот ПТГ из первых девяти циклов секвенирования. Нижняя панель изображает интерпретацию этого события сдвига рамки, полученную путем наложения последовательностей белка и мРНК. Кодон GGG, декодированный обратным (-1) проскальзыванием GGA-декодирующей тРНК Gly , выделен жирным шрифтом.

Рисунок 2

N-концевое секвенирование β-галактозидазы, очищенной из штамма, несущего мутацию рРНК C1407U, и конструкцию со сдвигом рамки считывания pSG12DP-1 lacZ .Показан выход в пмоль выбранных аминокислот ПТГ из первых девяти циклов секвенирования. Нижняя панель изображает интерпретацию этого события сдвига рамки, полученную путем наложения последовательностей белка и мРНК. Кодон GGG, декодированный обратным (-1) проскальзыванием GGA-декодирующей тРНК Gly , выделен жирным шрифтом.

Рисунок 3

Предлагаемый механизм сдвига рамки (после повторной инициации) в конструкции сдвига рамки pSGlac7 +1. Две нижние строки показывают последовательность белка, полученную в результате N-концевого секвенирования β-галактозидазы, очищенной от штамма, экспрессирующего мутацию рРНК G529U, и конструкции pSGlac7.

Рисунок 3

Предлагаемый механизм сдвига рамки (после повторной инициации) в конструкции сдвига рамки pSGlac7 +1. Две нижние строки показывают последовательность белка, полученную в результате N-концевого секвенирования β-галактозидазы, очищенной от штамма, экспрессирующего мутацию рРНК G529U, и конструкции pSGlac7.

Влияние мутаций декодирующего домена на распознавание кодонов в P-сайте

Триплет AUG является наиболее распространенным кодоном инициации во всех организмах, GUG и UUG используются нечасто, а AUU, AUA и AUC редко, если вообще используются.Инициаторная тРНК уникальна тем, что связывается непосредственно с Р-сайтом рибосомы. Факторы инициации и рибосомные белки участвуют в выборе правильного кодона инициации мРНК и тРНК и активно дискриминируют неинициаторные тРНК и кодоны. Пытаясь охарактеризовать влияние мутаций рРНК на функцию P-сайта, мы исследовали их влияние на уровни инициации кодонов, отличных от AUG. Мы пришли к выводу, что мутации, влияющие на функцию декодирования в P-сайте, могут изменить частоту инициации не-AUG-триплетов инициации.Инициирующий кодон AUG плазмиды pSG25 lacZ дикого типа был заменен на GUG, UUG и CUG (pSG431, pSG414 и pSG413 соответственно) или AUA, AUC и AUU (pSG416, pSG415 и pSG417 соответственно). Декодирование этих триплетов с помощью тРНКf Met во время инициации с нестандартных кодонов инициации включает несовпадение одиночных оснований кодон-антикодон в первом или третьем положениях и, таким образом, аналогично считыванию кодонов UGA с помощью тРНК Trp или UAA и UAG. кодоны тРНК Gln в А-сайте (25–27).Данные в таблице 3 показывают, что мутации в петле 530 (G529U) и спирали 34 (U1199C/C1200U и U1199G/C1200G), а также мутации в области C1400, описанные в предыдущем разделе, все стимулировали инициацию от каждого из кодоны инициации, отличные от AUG. Однако только некоторые из мутаций спирали 34 способствовали неправильному кодированию. Таким образом, мутация C1192U в спирали 34, придающая устойчивость к спектиномицину (28), не влияла на считывание стоп-кодона, сдвиг рамки считывания или инициацию событий (таблицы 2 и 3), что согласуется с ее отсутствием влияния на клеточный рост или 90–135 in vitro. параметров перевода (29).Чтобы охарактеризовать эти аберрантные события инициации, β-галактозидазу выделяли из выбранных штаммов и подвергали N-концевому секвенированию. Анализ последовательности β-галактозидазы, выделенной из штамма, несущего конструкцию pSG413 lacZ и мутацию рРНК G529U, показал, что, как и предполагалось, инициация происходила в кодоне CUG (рис. 4). Точно так же секвенирование белка показало, что в штамме, несущем плазмиду pSG415 lacZ и мутации рРНК U1199G/C1200G, инициация происходила в предсказанном кодоне AUC (рис.5). Эти данные ясно показывают, что мутации в трех разных областях 16S рРНК влияют на взаимодействие кодон-антикодон в рибосомном P-сайте, в то время как данные, представленные в предыдущем разделе и в наших предыдущих анализах (10,11,16), показывают, что те же самые области рРНК участвуют в отборе тРНК в А-сайте и в поддержании рамки считывания. Сходство функциональных эффектов этих мутантов позволяет предположить, что петля 530, область С1400 и спираль 34 участвуют в модулировании взаимодействий тРНК-рибосомы на множестве стадий во время трансляции.Более того, выделение супрессорных/антисупрессорных мутаций в эквивалентных положениях в рРНК малых субъединиц митохондрий и цитоплазмы дрожжей (в условиях, когда вся рРНК мутантна) предполагает участие этих трех областей рРНК в декодировании у всех организмов (7).

Рисунок 4

N-концевое секвенирование для определения инициирующего кодона, используемого в конструкции pSG413 lacZ . β-Галактозидазу выделяли из штамма, экспрессирующего мутацию рРНК G529U, и конструкции pSG413 lacZ .Показан выход в пмоль для выбранных аминокислот ПТГ, проанализированных для первых пяти циклов.

Рисунок 4

N-концевое секвенирование для определения инициирующего кодона, используемого в конструкции pSG413 lacZ . β-Галактозидазу выделяли из штамма, экспрессирующего мутацию рРНК G529U, и конструкции pSG413 lacZ . Показан выход в пмоль для выбранных аминокислот ПТГ, проанализированных для первых пяти циклов.

Инициация трансляции требует участия трех факторов инициации IF1, IF2 и IF3.IF3 участвует в отборе инициаторной тРНК, которая связывается с P-сайтом малой субъединицы. Фактор взаимодействует с областью антикодона ствол-петля тРНК и дестабилизирует комплексы инициации, содержащие неинициаторные тРНК или неканонические комплексы инициации (30). Эксперименты по сшиванию показали, что IF3 взаимодействует как с центральным, так и с 3′-минорным доменом 16S рРНК (31) и 30S рибосомными субъединицами, содержащими мутации в положениях G791 и A792 в петле 790 или в G1530/A1531 на 3′-конце 16S. Было показано, что рРНК дефектна в связывании с IF3 (17,18,32).Из-за влияния этих мутаций рРНК на взаимодействие рибосома-IF3 мы проанализировали их влияние на выбор кодонов инициации AUG. Эти данные, представленные в таблице 3, показывают, что мутанты A792U, A792G и G1530A/A1531G не увеличивают инициацию кодонов, отличных от AUG. Это указывает на то, что уменьшение взаимодействия рибосома-IF3 само по себе не влияет на выбор кодонов инициации AUG, но вместо этого предполагает, что анализируемые здесь мутации рРНК влияют на инициацию, снижая точность выбора тРНК в рибосомном P-сайте.

Таблица 3

Влияние мутаций рРНК на инициацию с кодонов, отличных от AUG

Таблица 3

Влияние мутаций рРНК на инициацию с кодонов, отличных от AUG

Рисунок 5

N-концевое секвенирование для определения инициирующего кодона, используемого в конструкции pSG415 lacZ , с использованием β-галактозидазы, очищенной из штамма, экспрессирующего мутацию рРНК U1199G/C1200G. Показан выход в пмоль для выбранных аминокислот ПТГ, полученный для первых четырех циклов.

Рисунок 5

N-концевое секвенирование для определения инициирующего кодона, используемого в конструкции pSG415 lacZ , с использованием β-галактозидазы, очищенной из штамма, экспрессирующего мутацию рРНК U1199G/C1200G. Показан выход в пмоль для выбранных аминокислот ПТГ, полученный для первых четырех циклов.

Взаимодействие G1505 с другими участками 16S рРНК

Наше более раннее исследование показало, что летальные эффекты мутаций в положениях 1395, 1400 и 1407 подавлялись второй мутацией в положении 1505 (15).В рамках нашей характеристики механизма супрессии были исследованы уровни ошибок трансляции, поддерживаемые комбинациями двойных мутантов рРНК C1395U/G1505U, △C1400/G1505U и C1407U/G1505U. Эти данные (таблица 2) показали, что в целом каждая из двойных мутантных рРНК увеличивает сдвиг рамки считывания и считывание стоп-кодона в той же (или большей) степени, что и любая из мутаций с одним основанием, и, таким образом, указывает на то, что двойные мутантные рРНК были активны в перевод. Супрессорный эффект замены оснований в положении 1505 не ограничивается мутациями в области С1400, поскольку Джемиоло и его коллеги восстановили мутацию G1505A как внутригенный супрессор двух летальных трансверсий в G1207 (33; D.Джемиоло, личное сообщение). G1505 находится в области рРНК, которая образует небольшую сшивку с IF3 (31). Взаимодействие G1505U и G791A, другой мутации, снижающей связывание IF3, исследовали путем объединения обеих мутаций в плазмиде, полученной из pNO2680. Измерения скорости роста штаммов, экспрессирующих различные рРНК, показали, что мутант дикого типа и мутант G1505U имели неразличимое время удвоения (относительное время удвоения = 1), в то время как мутант G791A/G1505U рос медленнее, чем мутант G791A (относительное время удвоения 1.8 и 1.3 соответственно). Таким образом, мутации в положении 1505 могут положительно или отрицательно взаимодействовать с вредными мутациями в разных положениях 16S рРНК. Негативное влияние G1505U на скорость роста мутанта G791A вместе с влиянием мутаций, содержащих G1505U, на точность трансляции (таблица 2) указывает на то, что подавление области C1400 и мутантов G1207 заменами оснований в G1505 не является следствием секвестрации. рРНК, кодируемых плазмидой, в непроцессированной или неактивной форме субъединицы.Более правдоподобная гипотеза состоит в том, что положения G791, G1207, C1395, C1400, C1407 и G1505 находятся в месте связывания незаменимого лиганда, такого как IF3, или рядом с ним, и модулируют его сродство к 30S-субъединице.

Влияние

ksg /A-зависимого диметилирования A1518 и A1519 на декодирование сайтов A и P

Считается, что антибиотик казугамицин ингибирует синтез белка, воздействуя на Р-участок рибосомы (34). Однако также сообщалось о влиянии касугамицина на декодирование сайта А (35).Устойчивость к антибиотику может возникать из-за мутаций метилазы KsgA, которая модифицирует A1518 и A1519 вблизи 3′-конца 16S рРНК. Дефицитные по метилазе штаммы ksgA⁻ дефектны во взаимодействиях субъединица-субъединица и IF3 и демонстрируют повышенные уровни считывания стоп-кодона и сдвига рамки считывания (35). Влияние немодифицированных A1518/A1519 на декодирование в P-сайте тестировали путем трансформации дефицитных по метилазе штаммов ksgA⁻ диапазоном конструкций инициирующего кодона lacZ .Данные, представленные в таблице 4, показывают, что штаммы ksgA⁻ также демонстрируют повышенные уровни инициации кодонами, отличными от AUG. Эти данные свидетельствуют о том, что в дополнение к изменениям в первичной структуре изменения в характере посттранскрипционной модификации 16S рРНК могут влиять на точность декодирования как в А-, так и в Р-сайтах.

Таблица 4

Эффекты ksgA-зависимой модификации рРНК на инициацию с кодонов, отличных от AUG

Таблица 4

Эффекты ksgA-зависимой модификации рРНК на инициацию с кодонов, отличных от AUG

Обсуждение

Эксперименты по химической защите и сшивке определили специфические основания в 16S рРНК, которые участвуют в связывании тРНК с сайтами А, Р и Е рибосомы, и помогли определить ориентацию тРНК на рибосоме (6).Представленные здесь данные показывают, что мутации в некоторых из этих положений, таких как G529, который был связан с функцией сайта A, и C1400, который был связан с функцией сайта P, влияли на декодирование как сайтов A, так и P. Это предполагает, что мутации в петле 530, области 1400–1500 и мутации в спирали 34 приводят к искажению сайта взаимодействия кодон-антикодон, что приводит к потере различения родственных и почти родственных тРНК в соседнем A и P-сайты.Влияние мутаций рРНК на селекцию тРНК может быть сходным с эффектом, вызываемым вызывающими ошибки аминогликозидными антибиотиками, которые, как полагают, усиливают неспецифические взаимодействия тРНК-рибосомы за счет точных взаимодействий кодон-антикодон (36). Ослабление специфических контактов мРНК-тРНК также согласуется с эффектами мутаций рРНК на проскальзывание тРНК, что приводит к ошибкам рамки считывания (табл. 2 и рис. 2). В этом контексте важно, что антибиотики стрептомицин и неомицин, а также усиливающие ошибку мутации в рибосомных белках S4 и S5 и ограничивающие ошибки мутации в рибосомном белке S12, как было показано, влияют на взаимодействие тРНК-рибосомы как на Сайты А и Р (37).Однако важное функциональное различие между этими рибосомными мутантами заключается в том, что в то время как мутации антибиотиков и рибосомных белков по-разному влияли на взаимодействия тРНК-рибосомы в рибосомных А- и Р-сайтах, описанные здесь мутации рРНК оказывали такое же усиливающее ошибки влияние на декодирование в участках рибосомы. оба сайта.

Область 1400–1500 16S рРНК

ТРНК, связанные с сайтом A и P, снижают или усиливают реактивность нескольких нуклеотидов в области 1400–1500 по отношению к химическим зондам (5), а аминогликозидные антибиотики, которые нарушают декодирование, защищают A1408, G1491 и G1494 (34).Более того, было показано, что позиции +4 и +7 на мРНК могут быть сшиты с основаниями C1402 и C1395 соответственно (38). Следовательно, эффекты мутаций области 1400-1500 на декодирование, вероятно, происходят из-за прямого нарушения взаимодействий тРНК-мРНК-рибосомы. Хотя нуклеотиды, окружающие С1400, изначально изображались одноцепочечными, недавний филогенетический и мутационный анализы показали, что нуклеотиды, соседние с С1400, представляют собой пары оснований с нуклеотидами, соседними с А1500 (39; рис.1). Таким образом, предполагается, что C1407 сочетается с G1494, и были получены генетические доказательства существования пар оснований G1401-C1501, C1404-G1497 и G1405-C1496 (40,41). Например, в проанализированной здесь мутации C1407U пара U-G заменила нативную пару CG. Анализ рибосом, несущих разрывы в третичных парах оснований или делеции в области 1400–1500, проведенный Офенгандом и его сотрудниками, показал, что мутации влияют на инициацию, а также на связывание тРНК с сайтами A и P (40–42). ).Это согласуется с нашими результатами, которые показывают, что нарушение центра декодирования мутациями C1395U, AC1400, C1407U и G1505U влияет на поддержание рамки считывания и влияет на взаимодействия тРНК-мРНК-рибосомы в соседних сайтах A и P.

Спираль 34

Выделение очевидно специфичной для UGA супрессорной мутации в положении C1054 в E.coli 16S рРНК привело к разработке модели терминации UGA (43). Эта модель предполагает, что распознавание терминирующего кодона UGA происходит посредством спаривания оснований между триплетом UGA и любым из тандемных триплетов UCA в основаниях 1199–1204 в спирали 34.Однако последующий анализ показал, что мутации в позициях C1054/C1200 или рядом с ними вызывали считывание всех трех стоп-кодонов, а также повышали уровни сдвига рамки считывания (11). В этом исследовании мы продемонстрировали, что эффекты мутаций в спирали 34 не ограничиваются фазой элонгации трансляции, но также влияют на точность декодирования в P-сайте во время инициации. Другая модель спаривания оснований рРНК-мРНК для терминации была предложена Tate et al. (44), основанный на сшивке терминирующего триплета UAA в положение A1408.Однако представленные здесь данные показывают, что мутация C1407U, которая изменяет предложенную последовательность распознавания терминирующих триплетов, не только влияет на считывание всех трех стоп-кодонов и сдвиг рамки считывания, но также влияет на точность декодирования при инициации. Более того, мутации в C1395, C1400 и G1505 провоцировали ту же картину ошибок декодирования сайтов A и P, что и мутация C1407U. Хотя эти результаты подчеркивают важность спирали 34 и региона C1400 в поддержании рамки считывания и взаимодействиях тРНК-мРНК как в сайтах A, так и в P, они не подтверждают специфического участия любого из этих регионов в терминации.Следовательно, эффекты мутаций в обеих этих областях 16S рРНК, скорее всего, происходят из-за нарушения взаимодействий тРНК-мРНК-рибосомы в целом, а не из-за специфического влияния на процесс терминации. Прямые доказательства связи 34-й спирали с взаимодействием мРНК-рибосома были получены в ходе экспериментов по сайт-направленному сшиванию, которые показали, что в то время как позиции +4 и +7 мРНК были сшиты с C1395 и C1402 соответственно, позиция +6 была сшита с U1052 в спирали 34. 38,45).Кроме того, тетрациклин, антибиотик, который ингибирует связывание тРНК сайта А, защищает A892 в центральном домене и U1052 и C1054 в спирали 34 от химической модификации (46). Т.о., хотя в спирали 34 нет тРНК-зависимых перекрестных связей или химической защиты, перекрестные связи мРНК и антибиотические следы вместе с генетическими данными, представленными здесь, указывают на участие спирали 34 в функциях декодирования при инициации и элонгации.

Петля 530

Генетические данные, связывающие петлю 530 с функцией декодирования, получены в результате выделения нонсенс-супрессорной мутации в положении G517 в митохондриях дрожжей (47) и мутаций, придающих устойчивость к вызывающему ошибки антибиотику стрептомицину в хлоропластах и ​​микобактериях (48,49).Участие петли 530 в декодировании и устойчивости к антибиотикам как в E.coli , так и в цитоплазматических рибосомах дрожжей было впоследствии установлено с помощью сайт-направленного мутагенеза оперонов рРНК (10,16,50,51). Анализ летальной мутации G530A Powers и Noller (52) показал, что эти мутантные рибосомы могут быть специфически дефектными во взаимодействиях EF-Tu-рибосомы. Кроме того, было обнаружено, что антибиотики и мутации рибосомных белков, которые способствуют неправильному кодированию, по-разному влияют на тРНК-зависимую защиту G530, но не на защиту A1492/A1493 в А-сайте (53).Эти результаты привели к развитию модели, которая предполагает, что конформация петли 530 по-разному реагирует на связывание родственного и неродственного тройного комплекса во время первоначального распознавания и проверки тРНК (52,53). Согласно этой модели, петля 530 влияет на связывание тРНК через ее влияние на взаимодействие рибосома-EF-Tu. Однако наши результаты показывают, что петля 530 может играть гораздо более непосредственную роль во взаимодействии тРНК-рибосомы и на нескольких стадиях трансляции. Мутация G529U влияет на поддержание рамки считывания и точность декодирования как во время фазы инициации, так и во время фазы элонгации трансляции.Связывание инициаторной тРНК с Р-сайтом рибосомы не связано с EF-Tu, и по крайней мере некоторые события рибосомного сдвига рамки считывания, на которые влияют мутации в петле 530, включают проскальзывание родственных тРНК в Р-сайте (а не неправильное перемещение не- родственные тРНК или внефазные тРНК, связывающиеся с сайтом А). Эти соображения, вместе с функциональным сходством мутации G529U с изменениями в 34-й спирали и области С1400, позволяют предположить, что все три области рРНК содержат декодирующий домен и что изменения в любой из трех областей оказывают сходное влияние на взаимодействие тРНК-рибосомы. .Эта интерпретация согласуется с данными о сшивании мРНК, которые показывают, что петля 530, спираль 34 и область С1400 образуют сшивки с мРНК между положениями +4 и +11 (38,45,54). С таким расположением декодирующего домена также согласуются недавние данные Хейлека и Ноллера (55), которые определили окрестности рРНК рибосомного белка S5 с помощью реагента для расщепления Fe(II)-ЭДТА, связанного с аминокислотой 21. С помощью этого реагента , расщепления наблюдались в петлях 420 и 530, центральном псевдоузле, областях 920 и 1400 и в спирали 34, что указывает на тесную физическую близость всех этих областей 16S рРНК.

Благодарности

Мы в долгу перед Эдвардом Минаном, докторами Джоном Аткинсом и Рэем Гестеландом за проведение анализа секвенирования белков, Стивеном Лодмеллом и Стивеном Грегори за создание некоторых плазмид pSG и Барбарой Бахманн, Мелвином Сантером и Мэтью Фирпо за предоставление плазмид и бактериальных штаммов. Мы благодарим доктора Джорджа К. Пеннаббла за его эрудированные идеи, Дэвида Джемиоло за то, что он поделился неопубликованными результатами, и наших коллег из лабораторий Дальберга и Циммермана за их комментарии к этой рукописи.Эта работа была поддержана грантами GM19756 для AED и GM22807 для RAZ от Национальных институтов здравоохранения.

Каталожные номера

1. , 

Nature New Biol.

,

1971

, том.

234

 (стр. 

261

264

)2. ,

год. Преподобный Биохим.

,

1991

, том.

60

 (стр. 

191

227

)3,  ,  ,  ,  . ,

Proc. Натл. акад. науч. США

,

1982

, том.

79

 (стр.

5450

5454

)4,  . ,

Природа

,

1994

, том.

377

 (стр. 

659

662

)5,  . ,

Дж. Мол. биол.

,

1990

, том.

211

 (стр. 

135

145

)6. ,

евро. Дж. Биохим.

,

1995

, том.

182

 (стр. 

501

506

)

 

7. ,  . , 

Рибосомная РНК, структура, эволюция, процессинг и функция в биосинтезе белка

1995

Boca Raton, FL

CRC Press

(стр.

277

309

)8,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  . ,

Биохим. Клеточная биол.

,

1995

, том.

73

 (стр. 

859

868

)9,  ,  . ,  ,  ,  ,  . , 

Трансляционный аппарат. Структура, функция, регулирование, эволюция

1993

New York, NY

Plenum Press

(стр. 

489

500

)10,  ,  . , 

Рез. нуклеиновых кислот.

,

1992

, том.

20

 (стр. 

4221

4227

)11,  .,

Дж. Мол. Биол

,

1994

, том.

243

 (стр. 

402

412

)12,  . ,

Proc. Натл. акад. науч. США

,

1993

, том.

90

 (стр. 

9214

9218

)13,  ,  ,  ,  ,  ,  . ,

Плазмида

,

1981

, vol.

6

 (стр. 

112

118

)14,  ,  ,  . ,

Proc. Натл. акад. науч. США

,

1985

, том.

82

 (стр. 

1069

1073

)15,  ,  ,  ,  ., 

Рез. нуклеиновых кислот.

,

1988

, том.

16

 (стр. 

8129

8146

)16,  ,  ,  ,  ,  . ,

РНК

,

1995

, vol.

1

 (стр. 

89

94

)17,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  . ,

Proc. Натл. акад. науч. США

,

1990

, том.

87

 (стр. 

3700

3704

)18,  ,  ,  . ,

J. Biol. хим.

,

1996

, том.

271

 (стр. 

4693

4698

)19,  ,  ,  ,  .,

EMBO J.

,

1993

, vol.

12

 (стр. 

2559

2566

)20,  . , 

Translational Control

1996

Plainview, NY

Cold Spring Harbour Laboratory Press

(стр.

653

685

)21,  ,  ,  . , 

Колд-Спринг-Харбор Симп. Квант. биол.

,

1987

, том.

52

 (стр. 

687

693

)22,  ,  . ,

Cell

,

1993

, vol.

74

 (стр.

93

103

)23,  . ,

Дж. Мол. биол.

,

1990

, том.

213

 (стр. 

811

818

)24,  . , 

Рез. нуклеиновых кислот.

,

1989

, том.

17

 (стр. 

5501

5507

)25,  . ,

Дж. Мол. биол.

,

1971

, том.

58

 (стр. 

459

468

)26,  ,  . ,

Дж. Мол. биол.

,

1966

, том.

18

 (стр. 

48

57

)27,  ,  ,  .,

Proc. Натл. акад. науч. США

,

1987

, том.

84

 (стр. 

8031 ​​

8034

)28,  ,  . , 

Рез. нуклеиновых кислот.

,

1984

, том.

12

 (стр. 

4653

4663

)29,  ,  ,  ,  . ,

EMBO J.

,

1990

, vol.

9

 (стр. 

735

739

)30,  ,  ,  . , 

Гены Dev.

,

1990

, том.

4

 (стр. 

1790

1800

)31,  ,  ,  ,  ,  ,  ., 

Рез. нуклеиновых кислот.

,

1986

, том.

14

 (стр. 

4803

4821

)32,  ,  . ,

Proc. Натл. акад. науч. США

,

1989

, том.

86

 (стр. 

4927

4931

)33,  ,  . , 

Рез. нуклеиновых кислот.

,

1991

, том.

19

 (стр. 

4259

4265

)34,  ,  ,  ,  . ,

EMBO J

,

1991

, том.

10

 (стр. 

3099

3103

)35,  ,  ., 

FEBLett.

,

1984

, том.

177

 (стр. 

119

124

)36. ,  ,  ,  ,  ,  . ,

Молекулярная основа действия антибиотиков

,

1981

New York, NY

Wiley

(стр.

402

547

)37, . ,

EMBO J.

,

1996

, vol.

15

 (стр. 

1149

1154

)38,  ,  ,  ,  ,  . , 

Рез. нуклеиновых кислот.

,

1993

, том.

21

 (стр.

283

2859

)39,  ,  . ,

Микробиолог. Ред.

,

, 1994,

, том.

58

 (стр. 

10

26

)40,  ,  ,  ,  ,  . ,

Биохимия

,

1992

, том.

31

 (стр. 

12012

12022

)41,  ,  ,  . ,

Биохимия

,

1993

, том.

32

 (стр. 

7172

7180

)42,  ,  ,  ,  ,  ,  . ,

Биохимия

,

1989

, том.

28

 (стр. 

1012

1019

)43,  ,  ,  . ,

Proc. Натл. акад. науч. США

,

1988

, том.

85

 (стр. 

4162

4165

)44,  ,  . , 

Рез. нуклеиновых кислот.

,

1990

, том.

18

 (стр. 

6537

6544

)45,  ,  . ,

EMBO J

,

1991

, том.

10

 (стр. 

2613

2620

)46,  . ,

Природа

,

1987

, том.

327

 (стр. 

389

394

)47,  . , 

Рез. нуклеиновых кислот.

,

1989

, том.

17

 (стр. 

4535

4539

)48,  ,  ,  . ,

Генетика

,

1989

, том.

123

 (стр. 

281

292

)49,  ,  ,  ,  . , 

Противомикробные агенты. Чемотер.

,

1994

, том.

38

 (стр. 

228

233

)50,  ,  . ,

EMBO J.

,

1994

, vol.

13

 (стр. 

906

913

)51,  ,  . , 

Рез. нуклеиновых кислот.

,

1988

, том.

16

 (стр. 

9631

9639

)52,  . ,

Proc. Натл. акад. науч. США

,

1993

, том.

90

 (стр. 

1364

1368

)53,  . ,

Дж. Мол. биол.

,

1994

, том.

235

 (стр. 

156

172

)54,  ,  . ,

J. Biol. хим.

,

1995

, том.

270

 (стр. 

12794

12800

)55,  . ,

Наука

,

1996

, том.

272

 (стр. 

1659

1662

)56. , 

Краткий курс бактериальной генетики

1991

Plainview, NY

Cold Spring Harbor Laboratory Press

57. , 

Nucleic Acids Res.

,

1994

, том.

22

 (стр. 

3502

2507

)

© 1997 Издательство Оксфордского университета

Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности.Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.


Настройка браузера на прием файлов cookie

Существует множество причин, по которым файл cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее распространенные причины:

  • В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки браузера, чтобы принять файлы cookie, или спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
  • Ваш браузер спрашивает, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались.Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файл cookie.
  • Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Попробуйте другой браузер, если вы подозреваете это.
  • Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы это исправить, установите правильное время и дату на своем компьютере.
  • Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie.Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.

Почему этому сайту требуются файлы cookie?

Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Предоставить доступ без файлов cookie потребует от сайта создания нового сеанса для каждой посещаемой вами страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.


Что сохраняется в файле cookie?

Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в файле cookie; никакая другая информация не фиксируется.

Как правило, в файле cookie может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, если вы не решите ввести его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступ к остальной части вашего компьютера, и только сайт, создавший файл cookie, может его прочитать.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.